重组细菌载体疫苗,尤其是重组减毒沙门氏菌疫苗（Recombinant Attenuated Salmonella Vaccine,RASV）,因其可以有效地激发宿主产生粘膜免疫反应、体液免疫反应以及细胞免疫反应的特点,已经被广泛用作递送保护性抗原和核酸疫苗的载体。RASV是具有构完整细菌结构的活疫苗,因此重组疫苗携带的外源性抗原或真核表达质粒难以从细菌中释放出来而发挥作用,而在体内残留的沙门氏菌也会造成生物污染。为解决上述问题,本研究基于细菌Ⅵ型分泌系统（TypeⅥSecretion System,T6SS）分泌的肽聚糖水解蛋白,设计了一系列由体内诱导启动子调控的裂解组合,并最终筛选出了一组由Mg²⁺调控的体内裂解系统去递送外源抗原。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的Ⅵ型分泌系统能够分泌两种肽聚糖水解因子Tse1和Tse3,这两种蛋白能够破坏细菌细胞壁结构造成细菌裂解死亡。本研究首先选用了三种内源性表达启动子,分别是限Mg2+调控启动子PpagC、限Fe2+调控启动子P_{viu B}以及组成型表达启动子araC P_BAD LacI-repressible P_trc。将以上三种启动子与两种周质定位信号肽基因blass（SS1）和pelBss（SS2）以及裂解基因tse1和tse3分别用融合PCR的方法组合在一起,然后用酶切和连接的方法将这些组合连入p15A-T（Cm⁺）载体中,转入大肠杆菌BL21（DE3）中以表达裂解蛋白Tse1和Tse3。最终筛选出的P_pagC-SS1/SS2-tse1组合能够在体外严谨调控大肠杆菌BL21（DE3）细胞的裂解。为了将筛选出的调控-裂解组合引入到沙门氏菌基因组中,将P_pagC-SS1/SS2-tse1组合连入自杀质粒载体,并转化到大肠杆菌χ7212,以同源重组方法构建沙门氏菌突变体UK-1ΔpagL::P_pagC-SS1/SS2-tse1。然而,突变体并未受到Mg²⁺的调控而出现裂解表型。为了解决这一问题,将P_pagC-SS2-tse1组合整合到Asd⁺的高拷贝质粒pYA3341中以构建裂解系统。结果构建成功的pUC-Lysis质粒在野生型鼠伤寒沙门氏菌株UK-1Δasd和减毒沙门氏菌株χ9241中均实现了可控的裂解表型。光学显微镜下观察到诱导后的菌株明显膨大变形,扫描电镜下则观察到细菌细胞壁结构被破坏。为进一步验证体外诱导下沙门氏菌裂解和释放抗原的效果,将p15A-LacZ（Cm⁺）质粒分别转入到空质粒对照组和携带裂解质粒的不同血清型的沙门氏菌中。结果在液体LB中培养时,对照组和试验组中菌液上清中释放的β-半乳糖苷酶/细菌总合成的β-半乳糖苷酶量的比值相当;而转入低Mg²⁺浓度的N-minimal培养基中诱导后,对照组的比值无明显变化而试验组的比值明显升高,说明该裂解系统能严谨地受到限Mg²⁺环境的诱导,实现沙门氏菌的裂解和外源抗原的释放。为了验证携带该裂解系统的沙门氏菌在小鼠体内的裂解效果,七周龄的小鼠以10⁹ CFU级别的剂量口服沙门氏菌株UK-1Δasd（pUC-Lysis）和χ9241（pUC-Lysis）。结果显示,11d后小鼠的肝脏和脾脏中均未检测出沙门氏菌,15d后派伊尔淋巴集结也没有沙门氏菌检出,说明该疫苗菌株能够在小鼠体内短暂定植后裂解。为了验证该RASV递送保护性抗原的免疫效果,将肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）外膜蛋白PspA的α螺旋区域（rPspA Rx1）克隆到pUC-Lysis质粒,成功构建了双调控蛋白表达质粒pUC-Lysis-PspA。结果携带该质粒的χ9241菌株依然能够表现出可控的裂解表型,Western-blot也能检测出rPspA Rx1蛋白条带。七周龄的小鼠以10⁹ CFU级别的剂量口服该疫苗菌株后,体内产生了针对rPspA Rx1抗原和沙门氏菌外膜蛋白的强烈免疫反应。综上所述,本研究构建了一种新型的体内调控的沙门氏菌裂解系统,该系统能够调控沙门氏菌在LB培养基中正常生长,在低Mg²⁺浓度的N-minimal培养基或进入小鼠体内诱导沙门氏菌的裂解,实现了保护性抗原的有效释放,并达到了生物防疫的目的。