【摘 要】
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研究背景目的重症肌无力（Myasthenia Gravis,MG）是由机体自身对神经肌肉接头处（Neuromuscular Junction,NMJ）的乙酰胆碱受体（Acetylcholinergic Receptor Antibody,AchR）产生免疫反应而引起的神经系统自身免疫性疾病。Ras超家族的小型Gtpases在整个神经发育过程,包括神经发生、分化、基因表达、膜和蛋白质运输、囊泡运输和
【基金项目】
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项目名称:Rho信号传导通路在重症肌无力发病机制中的作用,项目合同编号:2017GXNSFAA198042,广西壮族自治区科学技术厅,面上项目； 项目名称:MDAR抗体诱导自身免疫性脑炎血脑屏障破坏的机制研究,项目合同编号:2019GXNSFDA245032,广西壮族自治区科学技术厅,重点项目； 项目名称:Neuregulin/M
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研究背景目的重症肌无力（Myasthenia Gravis,MG）是由机体自身对神经肌肉接头处（Neuromuscular Junction,NMJ）的乙酰胆碱受体（Acetylcholinergic Receptor Antibody,AchR）产生免疫反应而引起的神经系统自身免疫性疾病。Ras超家族的小型Gtpases在整个神经发育过程,包括神经发生、分化、基因表达、膜和蛋白质运输、囊泡运输和突触可塑性的基本细胞过程中都起着至关重要的作用。本研究通过建立实验性自身免疫性重症肌无力（Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis,EAMG）大鼠模型,并使用Ras抑制剂法尼基硫代水杨酸（Farnesylthiosalicylic Acid,FTS）在体内阻断Ras信号通路,探究Ras信号通路在EAMG大鼠发病中的作用,以及对于神经肌肉接头处乙酰胆碱受体的影响。实验方法使用人工合成大鼠源性AchRα97-116肽段主动免疫Lewis大鼠EAMG模型,同时设立佐剂（Freunds Complete Adjuvant,CFA）对照组,通过观察并记录大鼠的体重、抓力,酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测大鼠血清乙酰胆碱受体抗体,低频重复神经电刺激（Reptitive Nerve Stimulation,RNS）刺激、透射电子显微镜下（Transmission Electron Microscope,TEM）观察神经肌肉接头处超微结构形态等方法及指标筛选EAMG模型成功大鼠。将模型成功大鼠随机分为EAMG组和EAMG+FTS组。予治疗组大鼠FTS（20 mg/kg）连续灌胃治疗7天后,无菌条件下分离大鼠腓肠肌,通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR,q RT-PCR）法检测各组大鼠骨骼肌组织中n AchRα7、n AchRα1、n AchRε、n AchRβ1和n AchRγm RNA的表达量;Western-blotting法比较各组大鼠骨骼肌组织中n AchRs、Ras、p38MAPK、p-p38MAPK的蛋白表达量以及p38MAPK磷酸化水平,免疫荧光法（Immunofluorescence,IF）观察肌肉组织中α-Bungarotoxin蛋白分布及表达情况。实验结果⑴EAMG大鼠模型的鉴定:与对照组大鼠相比,模型组的体重和抓力没有显著差别。EAMG组/CFA对照组大鼠血清抗AchRα97-116 Ig G≥2.1倍视为阳性,EAMG组OD值为1.96±0.089,CFA对照组为0.49±0.052,两组差异有统计学意义（P＜0.05）,EAMG模型成功率约为76%。透射电镜下观察到CFA组大鼠神经肌肉接头处突触结构完整,褶皱排列紧密、整齐,而EAMG大鼠NMJ处突触褶皱排列稀疏、不规则;EAMG组低频重复神经电刺激衰减率＞25%。⑵RT-PCR结果示:与CFA对照组相比,EAMG组n AchRα7、α1、β1亚基m RNA表达量显著降低（P＜0.05）,n AchRε亚基m RNA表达量显著升高（P＜0.05）;使用FTS后,与EAMG组相比,EAMG+FTS组n AchRα7亚基m RNA表达量显著升高（P＜0.05）,n AchRγ、ε亚基m RNA表达量显著降低（P＜0.05）,n AchRα1、β1亚基m RNA表达量未见改变。⑶Western-blotting结果显示:与CFA组相比,EAMG组大鼠骨骼肌中n AchRα7蛋白表达量显著降低（P＜0.05）,使用FTS后,n AchRα7蛋白表达量仍然降低;CFA、EAMG组和EAMG+FTS组大鼠骨骼肌Ras蛋白表达量未见明显差异;与CFA相比,EAMG组中Ras下游通路蛋白p-p38MAPK蛋白表达量显著升高（P＜0.05）,且p38MAPK磷酸化水平显著升高（P＜0.05）,使用FTS治疗后p38MAPK磷酸化水平略有下调,但未达到统计学意义;⑷免疫荧光镜下观察到:与CFA组相比,EAMG组大鼠肌肉组织中α-Bungarotoxin表达量减少,使用Ras抑制剂后,未见明显变化。结论采用人工合成大鼠源性AchRα97-116肽段主动免疫Lewis大鼠,可以成功建立EAMG大鼠模型。阻断Ras信号通路后,可以上调EAMG大鼠骨骼肌组织中下降的n AchRα7、ε亚基的m RNA表达水平。Ras还通过激活其下游MAPKs途径,上调p-p38MAPK蛋白表达量,调节EAMG大鼠肌肉中n AchRα7蛋白的表达。由此推测,Ras-p38MAPK信号通路可能参与实验性免疫性重症肌无力大鼠的发病。
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