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目的:胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）是一种高度侵袭性恶性消化道肿瘤,由于远处转移和复发的发生率很高,再加上缺乏有效的治疗手段,并且对大多数治疗方法有耐药性,是预后最差的恶性肿瘤之一。肿瘤干细胞（cancer stem cell,CSC）是存在于肿瘤组织中的一小部分具有干细胞性质的细胞群体,具有自我更新、多向分化、无限增殖和强致瘤能力。大量研究表明,肿瘤干细胞参与胰腺导管腺癌的肿瘤发生和进展,并对化疗和放疗产生耐药性,是其临床预后差的重要因素,因此积极寻求肿瘤干细胞在胰腺导管腺癌治疗中的新思路,有助于改善预后和延长生存期。TRIM29是三结构域蛋白（tripartite motif-containing proteins,TRIM）家族成员之一,也称为共济失调性毛细血管扩张D组互补基因（Ataxia Telangiectasia group D-associated protein,ATDC）,位于染色体11q23。TRIM家族蛋白通常因为具有RING环被定义为E3泛素连接酶,而TRIM29包含B1-B2-CC结构域,却缺乏RING环,因此不属于E3泛素连接酶,而近期有研究指出TRIM29也具有微弱的E3泛素连接酶功能。TRIM29的改变与肿瘤发生、增殖、侵袭和淋巴结转移等密切相关,其在不同组织来源的癌细胞中分别具有促癌或抑癌作用。TRIM29在胰腺导管腺癌中作为致癌因子发挥作用,但具体分子机制仍有待于进一步研究。干扰素刺激基因15（Interferon-stimulated Gene 15,ISG15）是一个在I型干扰素刺激下产生的类泛素样蛋白,其分子质量约为15-kDa,可通过酶级联反应共价修饰靶蛋白,从而发挥生物学功能。ISG15除了能结合潜在的数百种靶蛋白,还能以游离形式存在于细胞内,也能以游离形式从细胞内分泌到细胞外。ISG15和ISG化涉及多种关键的细胞过程,包括蛋白质翻译、自噬、DNA修复和免疫调节等,参与癌症和免疫疾病的调节。鉴于ISG15结构的特殊性以及复杂性使ISG15在不同的肿瘤中分别发挥促癌或抑癌的作用。目前的研究揭示胞外游离型ISG15可能作为肿瘤干细胞的支持因子在胰腺导管腺癌中发挥促癌作用,但ISG15和ISG化的具体作用机制仍然有待阐明。在前期的工作中,本研究发现TRIM29表达下调能抑制胰腺导管腺癌干细胞样表型。对72例胰腺导管腺癌组织样本分析发现TRIM29和ISG15呈显著正相关。在胰腺导管腺癌细胞中,TRIM29表达下调会通过促进ISG15蛋白降解而抑制ISG15的蛋白表达,ISG15蛋白降解的具体途径还暂未报道,因此本研究对ISG15降解途径进行了探索,揭示TRIM29表达下调是通过增加CAPN3的表达进而促进ISG15蛋白降解的分子机理。本研究还发现TRIM29表达下调会降低ISG15的自分泌功能,且胞外ISG15通过自分泌作用维持胰腺导管腺癌干细胞样表型。此外,ISG15能恢复由TRIM29表达下调所导致的胰腺导管腺癌干细胞样表型的抑制不依赖于其结合功能。因此本研究旨在对TRIM29通过ISG15调控胰腺导管腺癌干性的具体机制进行解析,揭示ISG15蛋白的具体降解途径,明确共价结合型及游离型ISG15的作用,有助于为胰腺导管腺癌治疗寻找新的药物靶点,而且有望为肿瘤的治疗提供新的思路和途径。研究方法:1、通过构建PDAC的TRIM29敲低细胞系,应用Edu掺入、平板克隆形成、Transwell、球囊形成和裸鼠成瘤实验研究TRIM29对细胞的增殖能力、侵袭性、肿瘤干细胞形成和体内异种移植瘤形成能力的影响。2、通过RT-qPCR和Western blot技术验证PDAC细胞中TRIM29敲低对ISG15的mRNA和蛋白表达水平的影响。3、应用Western blot技术验证TRIM29敲低PDAC细胞中P62、LC3等自噬相关蛋白和钙蛋白酶家族成员表达,在加入蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHX）、蛋白酶体MG132、溶酶体抑制剂E64D+pepstainA、自噬抑制剂CQ及Baf A、钙蛋白酶抑制剂Z-LLY-FMK后检测细胞中ISG15蛋白表达,明确ISG15降解途径。3、应用pcDNA3.1-FLAG载体构建ISG15（WT）、ISG15（D76A）和ISG15（E115A）质粒,将其分别转入TRIM29敲低PDAC细胞中后加入CHX,利用Western blot检测ISG15蛋白表达,明确ISG15具体降解途径。4、在PDAC的TRIM29敲低细胞系中恢复ISG15表达或下调CAPN3和HERC5的表达,利用克隆形成、Transwell、球囊形成、裸鼠成瘤实验检测肿瘤干细胞样表型变化。5、应用Dot blot实验检测PDAC的TRIM29敲低细胞分泌到培养基中ISG15表达水平。6、加入ISG15中和抗体和重组蛋白后分别利用Transwell实验和球囊形成实验研究胞外ISG15与肿瘤干细胞样表型的关系。结果:1、TRIM29表达下调抑制胰腺导管腺癌干细胞样表型。2、TRIM29表达下调在翻译后水平调节蛋白降解抑制ISG15的表达。3、TRIM29表达下调通过增加CAPN3表达进而促进ISG15的蛋白降解。4、ISG15能恢复由TRIM29表达下调所导致的胰腺导管腺癌干细胞样表型的抑制不依赖于其结合功能。5、CAPN3敲低能部分挽救由TRIM29表达下调所抑制的胰腺导管腺癌干细胞样表型。6、TRIM29表达下调通过降低ISG15的自分泌功能抑制胰腺导管腺癌干细胞表型。结论:TRIM29表达下调通过促进CAPN3表达进而促进ISG15的蛋白降解来抑制胰腺导管腺癌干细胞样表型,通过恢复不依赖结合功能的游离型ISG15的表达可挽救此现象,且胞外ISG15通过自分泌作用维持胰腺导管腺癌干细胞样表型。