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背景和目的孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder,ASD）是多因素引起的广泛性神经发育障碍性疾病,常发病于儿童早期,严重影响患儿的社会交往、言语能力,给家庭和社会带来沉重负担。目前,ASD精确的发病机制尚不清楚,诊断主要依靠DSM-5孤独症行为量表,缺乏具有共识的客观指标,治疗策略有限,缺乏治愈手段。我们前期研究发现ASD儿童粪便和血清中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等有明显的升高,在ASD模型小鼠的肠道和血清中也明显增加。小胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system,CNS）的先天免疫细胞,起源于胚胎卵黄囊中的红骨髓细胞,在CNS组织维持、损伤反应和病原体防御中发挥关键作用。小胶质细胞被激活,代表神经病变的发生,其在不同的脑区导致的神经炎症均有研究报道。本研究旨在通过动物和细胞模型研究,对儿童ASD的发病机制进行深入探讨,特别是对促炎因子TNF-α通过腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）信号通路介导小胶质细胞自噬受限而持续激活在ASD发病中的作用及机制进行深入的阐述。实验方法SD大鼠雌雄合笼后见阴栓算作孕0.5天,在孕12.5天给予孕鼠一次性腹腔注射丙戊酸钠（valproic acid,VPA）溶液600mg/Kg,对照组注射同等体积的生理盐水。子代雄鼠作为实验对象（模型组为VPA组,对照组为SAL组）,生后第6周进行行为学测试鉴定模型是否构建成功。测试结束后,流式细胞术分析各组大鼠激活状态小胶质细胞比例。实时荧光定量PCR检测各组大鼠结肠组织和前额皮质层炎症因子TNF-α、IL-1β、INF-γ、IL-6等相关基因m RNA表达。使用免疫荧光技术检测小胶质细胞在前额皮质层的激活状况,并通过Western Blot检测脑组织自噬相关蛋白LC3、p62表达,检测AMPK和磷酸化AMPK（p-AMPK）表达以及下游Unc-51样自噬激活激酶1（unc-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1）蛋白磷酸化水平。体外细胞实验通过给予小鼠BV2细胞不同剂量的TNF-α、AMPK激动剂观察不同时间段BV2细胞变化,并检测LC3、p62以及AMPK、p-AMPK蛋白表达。结果1.行为学特征:VPA组大鼠旷场实验中相较正常组活动总路程明显增加（P＜0.05）,外周区域活动路程明显增加（P＜0.05）;VPA组大鼠三室社交实验中相较对照组接触陌生物体的时间明显增加（P＜0.001）,接触陌生鼠的时间明显减少（P＜0.001）,接触陌生鼠/接触陌生物体比值明显减少（P＜0.05）;超声发声实验中VPA组大鼠相较对照组高频（50-100k Hz）和低频（20-50k Hz）的发声次数和发声持续时间均明显减少（P＜0.001）;新物体识别实验中VPA组大鼠识别指数相较于SAL组明显减低（P＜0.001）;VPA组大鼠在埋珠实验中相较对照组无明显差异,无统计学意义。实验组大鼠出现了自发活动增加、认知障碍和社交障碍等行为学症状,使用VPA成功构建ASD大鼠模型。2.肠道炎症和前额皮质层炎症:VPA组大鼠结肠组织和前额皮质层促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ等m RNA表达相较对照组显著增加（P＜0.05）。3.小胶质细胞持续激活:VPA组大鼠脑组织中激活的小胶质细胞占比增加（P＜0.01）;共聚焦显微镜下VPA组大鼠前额皮质层小胶质细胞形态发生变化,胞体变圆,分支变少,发生M1极化细胞数量显著增加;BV2细胞在50ng/ml浓度的TNF-α处理后出现持续激活状态,激活的BV2细胞呈阿米巴样改变,在2h达到顶峰。4.小胶质细胞自噬能力受限:与对照组大鼠相比,Western Blot实验结果中LC3Ⅱ蛋白表达降低（P＜0.05）,p62蛋白明显增加（P＜0.05）。BV2细胞在50ng/ml浓度的TNF-α处理24h后,共聚焦显微镜下1%血清饥饿+TNF-α50ng/ml组LC3荧光强度则明显弱于1%血清饥饿组。5.AMPK及ULK1通路表达:与对照组大鼠相比,VPA组大鼠脑组织中总AMPK表达无明显差异,p-AMPK表达明显下降,AMPK通路下游参与调控自噬的ULK1蛋白及磷酸化ULK1蛋白（p-ULK1）表达明显下降。细胞实验中,与空白对照组相比,TNF-α组LC3Ⅱ蛋白表达明显降低;TNF-α+AICAR（AMPK激动剂）组LC3Ⅱ蛋白表达水平无明显差异;AICAR组LC3Ⅱ蛋白表达增加;Compound C（AMPK抑制剂）组LC3Ⅱ蛋白表达减少。结论肠道产生的TNF-α可能通过受损的血脑屏障进入中枢神经系统,并通过AMPK/ULK1通路抑制小胶质细胞自噬,自噬能力受限的小胶质细胞无法保持其自稳状态从而处于长期激活状态,释放更多炎症介质,进而导致了ASD症状的发生。