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丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,简称HCV）的非结构蛋白3（non-structuralprotein 3 NS3）和非结构蛋白5A（non-structural protein 5A NS5A）分别为HCV诊断第二代、第三代酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay ELISA）所必需的片段,对于HCV临床诊断有重要意义。本研究通过基因工程方法得到丙型肝炎病毒NS5A的长短两片段与NS3的全长序列,并进行了初步的免疫学检测鉴定。以含丙型肝炎病毒全基因的质粒pBRtm/HCV-3011（1b型）为模板,经PCR方法扩增出编码丙型肝炎病毒的第三代抗-HCV酶联免疫吸附实验所需全长NS5A和高免疫源区NS5A蛋白（氨基酸2212-2313）的基因,分别命名为NS5AL和NS5AS,克隆入pET-32a载体中,成功构建重组表达载体pET-NS5AL和pET-NS5AS,将pET-NS5AL转化大肠杆菌Rosetta（DE3）pLsS、pET-NS5AS转化大肠杆菌BL21（DE3）,成功构建工程菌,分别命名为Rosetta（DE3）pLysS- NS5AL、BL21（DE3）-NS5AS,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析NS5AL出现一条约68kDa的条带,NS5AS出现一条约39kDa的条带,与预期融合蛋白的分子量相符,Western-blot显示诱导后的菌体在相应的位置出现特异性的杂交带,通过Ni-NTAAgarose纯化重组蛋白,得到了浓度分别为0.146mg/mL、0.426mg/mL,纯度超过96%的目的蛋白,选择5例确诊HCV感染者的阳性血清,通过ELISA对重组蛋白NS5AL与NS5AS的检测性进行鉴定,并比较两重组蛋白的检测灵敏度,ELISA结果表明:重组蛋白NS5AL与NS5AS都具有良好的免疫学检测效果,且重组蛋白NS5AL的检测灵敏度明显高于NS5AS。将克隆有NS3基因的重组质粒pProEX-HTb-NS3转化BL21（DE3）,成功构建工程菌BL21（DE3）-NS3,IPTG诱导表达NS3蛋白,进行SDS-PAGE与Western-Blot分析,NS3出现一条约为72kDa的条带,Ni-NTA Agarose纯化重组蛋白NS3,得到了浓度为0.346mg/mL、纯度超过93%的重组蛋白NS3,ELISA方法证明了纯化后的蛋白具有良好的免疫学检测效果。本研究运用原核表达体系,成功地得到了NS5A蛋白的长短片段和全长的NS3蛋白。ELISA结果表明NS3具有很好的免疫学检测效果;NS5AL的检测灵敏度优于NSSAS,在将来临床应用中,长片段NS5AL能够弥补较短片断特异性较强,而灵敏度不足的缺陷,可以更好地应用于HCV的临床检测。同时也为研究HCV NS5A、NS3的其它生物学功能奠定基础。