小麦防御素基因TaPDF35和氧—甲基转移酶基因TaOMT-3D的表达和功能分析

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小麦纹枯病,又称为尖眼点病,是由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的重要的小麦土传真菌病害。近年来,小麦纹枯病的发病情况呈加重趋势,对小麦的产量和品质产生了严重的影响。目前,种植的小麦品种对纹枯病的抗性普遍较低。为了提高小麦品种对纹枯病的抗性,急需挖掘小麦抗纹枯病重要基因,并对其功能进行研究,以期创建抗纹枯病小麦新种质。本文研究了小麦防御素基因TaPDF35和氧-甲基转移酶基因TaOMT-3D的表达特性及其在防御纹枯病反应中的功能。主要结果如下:TaPDF35基因包含一个长为249bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF),编码82个氨基酸组成的多肽TaPDF35。预测分析表明,TaPDF35蛋白具有防御素的典型结构,N端有一段27个氨基酸的信号肽;C端能形成由一个α螺旋和三股反向平行的β-折叠片组成的αβ(CSαβ)基序,并且αβ(CSαβ)基序由八个半胱氨酸形成的4个二硫键固定。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,分析TaPDF35基因在对纹枯病抗性程度不同的小麦品系(品种)中的相对表达量。结果表明,TaPDF35基因在小麦品种(品系)中的表达量与寄主对纹枯病的抗性程度基本呈正相关;TaPDF35基因在抗纹枯病小麦品系CI12633中表达量最高,其次是抗纹枯病小麦品系山红麦,在中抗纹枯病小麦品系山农0431中的表达量中等,在感纹枯病小麦品种扬麦158中的表达量最低。qRT-PCR分析TaPDF35基因在抗纹枯病小麦品系CI12633的叶鞘和茎的表达量。结果表明,TaPDF35基因在小麦的叶鞘和茎中都有表达,且受纹枯病原菌(R.cerealis)诱导而上调表达。运用大麦条形花叶病毒(Barley stripe mosaic virus,BSMV)诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术,降低抗纹枯病小麦品种CI12633中TaPDF35基因的表达量,再接种纹枯病原菌(R.cerealis)进行纹枯病抗性鉴定。qRT-PCR分析结果表明,与接种BSMV:GFP的CI12633植株相比,接种BSMV:TaPDF35的CI12633中TaPDF35基因的表达水平显著降低。对上述植株进行纹枯病抗性鉴定。结果表明,与接种BSMV:GFP的CI12622植株相比,接种BSMV:TaPDF35的CI12633植株对纹枯病的抗性显著降低,表明TaPDF35表达是小麦防御纹枯病反应所需的。氧-甲基转移酶参与黄酮类甲基化代谢途径、木质素生物合成以及二苯乙烯的生物合成。TaOMT-3D是从基因芯片数据筛选出来的,并且在抗性小麦品系中表达量较高的一个氧-甲基转移酶编码基因。利用q RT-PCR方法,分析TaOMT-3D基因在抗纹枯病程度不同的小麦品系(品种)中的相对表达量。TaOMT-3D基因在小麦品种(品系)中的表达量与寄主对纹枯病的抗性基本呈正相关;TaOMT-3D基因在抗纹枯病小麦品系山红麦中表达量最高,其次是抗纹枯病小麦品系CI12633,在中抗纹枯病小麦品系山农0431中的表达量中等,在感纹枯病小麦温麦6中的表达量最低。为了分析TaOMT-3D在小麦防御纹枯病反应中的作用,利用BSMV-VIGS技术降低抗纹枯病小麦品种CI12633中Ta OMT-3D基因的转录水平,再接种禾谷丝核菌(R.cerealis)进行纹枯病抗性鉴定。qRT-PCR分析结果表明,与接种BSMV:GFP的CI12633植株相比,接种BSMV:TaOMT-3D的CI12633中TaOMT-3D基因的表达水平显著降低。对上述植株进行纹枯病抗性鉴定。结果表明,与接种BSMV:GFP的CI12622植株相比,接种BSMV:TaOMT-3D的CI12633植株对纹枯病的抗性显著降低。说明,Ta OMT-3D表达是小麦防御纹枯病反应所需的。构建了TaOMT-3D过表达的转化载体pMWB122-TaOMT-3D,通过农杆菌介导法转入到推广小麦品种扬麦16,得到转TaOMT-3D基因的转基因小麦。对TaOMT-3D转基因小麦T0-T2代植株进行PCR检测结果表明,该转基因表达盒在5个转基因小麦株系中传递。qRT-PCR分析在T1-T2代转基因小麦株系中TaOMT-3D基因转录情况。结果表明,与受体扬麦16相比,TaOMT-3D基因在转基因株系中的表达量显著提高。对TaOMT-3D过表达转基因小麦株系进行Western blot分析,结果表明,转入的TaOMT-3D基因能够在5个转基因小麦株系中超量翻译表达。对转基因小麦株系进行纹枯病抗性鉴定。结果表明,Ta OMT-3D转基因小麦T1代5个株系对纹枯病的抗性均显著高于受体扬麦16,5个转基因小麦株系病情指数分别是:26.7、26.7、26.7、33.3和45.0,受体扬麦16的病情指数为58.3。综上结果表明,TaOMT-3D基因在小麦防御纹枯菌反应中具有重要的作用,创制的抗纹枯病的转基因小麦新材料,在抗纹枯病小麦分子育种中具有潜在的应用价值。
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