1.单表达H5亚型禽流感不同毒株HA基因的重组鸡痘病毒的构建及鉴定 通过分析不同毒株的遗传进化关系，及它们与针对H5亚型禽流感病毒(avianinfluenzavirus，AIV)血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白的单抗的反应性，选取了4株在遗传进化上属于不同的分支，抗原性上也具有一定差异的H5亚型AIV。其中包括1株H5N2亚型北美弱毒株(WK)，及3株H5N1亚型高致病性亚洲分离株：1株属于clade0(N36)，另2株属于clade2.3.4(SY和LK)。 以这4株AIV为供体，分别获取它们的HA基因并构建了4株重组鸡痘病毒(recombinantfowlpoxvirus，rFPV)。经鉴定它们中的目的基因都得到了正确的表达。 2.在重组鸡痘病毒或灭活疫苗水平研究H5亚型禽流感病毒的亚型内交叉保护性 为了研究H5亚型内不同AIV毒株之间的交叉保护能力，我们选择了具有不同进化关系和抗原性的4株H5亚型AIV(SY、LK、N36和WK)作为研究对象。以SY株为参照，其它3株AIVHA蛋白的AA同源性为：WK:89.6％；N36:94.2％；LK:99.5％。分别以这4株AIV为抗原制作全病毒灭活疫苗，将它们分别免疫SPF鸡，同时将以这4株AIV为HA基因供体而构建的4株rFPVs(rFPV-SYHA、rFPV-LKHA、rFPV-N36HA及rFPV-WKHA)分别免疫SPF鸡。免疫后第21d，将各组鸡用SY株高致病性禽流感病毒(HPAIV)以1×105EID50的剂量通过滴鼻点眼途径进行攻击。通过比较各组的死亡率，排毒率及排毒量等指标，分别在全病毒灭活苗及表达HA蛋白的rFPV水平上，对它们之间的交叉保护程度进行研究。 在全病毒灭活疫苗水平，各灭活苗均对免疫鸡提供了显著水平的死亡保护。但WK株灭活苗未能对免疫鸡提供100％的死亡保护，且死亡比例较高(11/20)，而其它3组均未出现发病或死亡。WK免疫组的气管排毒率在攻毒后的第2d和第4d均显著高于同源毒株免疫组(SY)，其气管的排毒量在攻毒后的第2d亦显著高于同源毒株免疫组(SY)。 在rFPV疫苗水平，各免疫组均对免疫鸡提供了显著水平的死亡保护。而rFPV-WKHA和rFPV-N36HA免疫组均出现不同程度的死亡，死亡比例分别为：12/20和5/20，均显著高于同源抗原(rFPV-SYHA)免疫组及与SY株遗传距离最小的LK抗原(rFPV-LKHA)免疫组，后两组均无发病或死亡病例发生。rFPV-WKHA免疫组在攻毒后第2d和第4d的气管排毒率，及rFPV-N36HA免疫组在攻毒后第4d的气管排毒率显著高于同源抗原(rFPV-SYHA)免疫组及与SY株遗传距离最小的LK抗原(rFPV-LKHA)免疫组。而rFPV-SYHA与rFPV-LKHA免疫组的排毒率在各个时间点上的排毒率均较低，且之间无显著差异。rFPV-WKHA免疫组的气管排毒量在攻毒后的第2d及第4d均显著高于同源抗原免疫组(rFPV-SYHA)。 3.单表达新城疫病毒不同毒株HN基因的重组鸡痘病毒的构建与鉴定 通过分析不同毒株的遗传进化关系，及它们与针对新城疫病毒(NDV)血凝素神经氨酸酶蛋白(HN)的单抗的反应性，选取了4株NDV(GM、H3、F48E8和LaSota)，它们在遗传进化上隶属于不同的分枝，HN蛋白的抗原性上也具有一定差异。其中2株(GM和H3)属于我国近年来的流行优势基因VII型；LaSota为常用疫苗株，属基因II型：F48E8为中国标准强毒株，属于基因IX型。 以这4株NDV为HN基因供体，构建了4株相应的rFPV(rFPV-GMHN、rFPV-H3HN、rFPV-F48HN和rFPV-LASHN)。经鉴定它们中的目的基因都得到了正确地表达。本研究为进一步在rFPV水平上对NDV不同毒株的交叉保护能力进行研究，并为筛选对流行株具有理想保护效力的rFPV候选疫苗株打下了基础。 4.在重组鸡痘病毒或灭活疫苗水平研究新城疫病毒不同毒株之间的交叉保护性 为了研究不同遗传距离和抗原性NDV毒株之间(或其主要保护性蛋白HN之间)的交叉保护能力。选取了4株(GM、H3、F48E8和LaSota)在遗传距离和抗原性上均有差异的NDV为受试毒株，与GM株相比，LaSota、F48E8和H3在HN蛋白上的AA同源性分别为88.3％、90.0％和98.3％。将这4株NDV制作全病毒灭活疫苗，并分别免疫SPF鸡。同时将4种rFPV(分别以以上4株NDV为HN基因供体)也以相同剂量(2×104PFU)分别免疫SPF鸡。免疫后21d，用GM株强毒NDV以1×105EID50(0.1mL)的剂量经滴鼻点眼途径对以上各组进行攻击。于攻毒后第3d、5d和7d对各组采集泄殖腔及气管拭子样品；攻毒后第5d，每组取6只鸡捕杀后取不同的脏器样品。分别以鸡胚接种法和荧光实时PCR法(RRT-PCR)对棉拭或脏器样品中的病毒进行检测。 免疫后21d，各组均产生了显著水平的抗体(不论是以同源抗原进行检测还是异源抗原)，各油苗组的抗体滴度均显著高于相应rFPV免疫组。各组血清的抗体均以同源性抗原检测到的滴度最高，除H3灭活苗及rFPV-H3HN免疫组例外，即由异源性抗原GM检测到的抗体滴度反而略高于同源性抗原H3的检测结果。攻毒后，未免疫对照组在攻毒后5d内全部发病死亡，其它各灭活苗或rFPV免疫组均未出现发病及死亡病例。 用鸡胚接种法对各株NDV灭活疫苗组拭子样品的检测结果显示：除LoSata灭活疫苗之外，其它3组在攻毒第3d的气管排毒率均得到了显著的降低。攻毒后第5d和第7d的气管或泄殖腔样品的病毒分离率均较低，且各组之间无显著差异。用鸡胚接种法对各rFPV免疫组的拭子样品的检测结果显示：除rFPV-GMHN免疫组外，其它3组在攻毒后第3d的气管排毒率均未得到显著降低。在攻毒后第3d，各rFPV免疫组泄殖腔样品的病毒分离率都得到了显著降低。在攻毒后第5d,rFPV-LASHN与rFPV-F48HN免疫组泄殖腔样品的病毒分离率均显著高于同源抗原组(rFPV-GMHN)及与同源抗原最相近的抗原组(rFPV-H3HN)。 用RRT-PCR法在对各组的拭子样品的检测结果显示：RRT-PCR法检测的敏感性总体高于鸡胚接种法。各rFPV免疫组在攻毒第3d的气管样品的阳性率均未得到显著降低。在攻毒后第Sd，rFPV-LASHN与rFPV-F48HN免疫组气管样品的阳性率均显著高于rFPV-GMHN及rFPV-H3HN免疫组。 5.两株表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力 为获得能更好地克服母源抗体干扰的rFPV，本研究将H9亚型AIVHA基因插入到具有新复制非必需区的通用型质粒载体pP12LS中构建转移载体pP12LSH9A，再分别转染预先感染不同毒力的两种鸡痘病毒(Fowlpoxvirus，FPV)282E4和LP株的鸡胚成纤维细胞，经系列蓝斑筛选纯化，获得了两种重组鸡痘病毒(rFPV)：rFPV282-12LSH9A和rFPVLP-12LSH9A。将这两株rFPV在SPF鸡和带有高水平抗H9亚型AIV母源抗体的商品鸡上分别进行免疫效力试验。结果：rFPV282-12LSH9A和rFPVLP-12LSH9A在SPF鸡上的排毒保护率均为100％(10/10)，在商品鸡上的排毒保护率分别为88％(23/26)和92％(24/26)。结论：获得了两株在带有抗H9亚型AIV高水平母源抗体的商品鸡上免疫效力较好的rFPV。 6.三种重组鸡痘病毒联合与单独免疫效力比较 利用针对不同病原的rFPV在鸡群进行间隔性的多次免疫时，后期免疫会受到前期免疫所诱生的载体特异性免疫反应的干扰，并导致其免疫效力下降。将这些rFPV进行联合免疫或许是解决此问题的一种策略。为验证rFPV联合免疫的可行性，本研究将三种针对不同病原的rFPV以联合或单独的方式分别进行免疫，并对它们的免疫效力进行比较。rFPV-12LSH9A，rFPV-12LSH5NA及rFPV-12LSHN为分别表达H9亚型AIVHA基因、H5亚型AIV的HA和NA基因及NDVHN基因的三种rFPV。将这三种rFPV分别在SPF鸡和带有针对H9、H5亚型AIV及NDV三种病原母源抗体的商品鸡上进行联合或单独免疫，并对这两种形式的免疫效力进行比较与分析。结果显示，这三株rFPV在SPF鸡上进行联合免疫时，所诱生的体液免疫应答受到了一定程度的抑制；个别成员株的排毒及死亡保护也受到了显著的干扰。因此，在进行rFPV联合免疫时，有必要对各成员株rFPV的免疫效力进行比较分析，以确定其可行性。 7.重组鸡痘病毒首免与灭活疫苗疫苗加强免疫提高对高致病性禽流感的免疫效果 为寻找一种在有母源抗体的商品鸡上更为有效的免疫策略，本研究用表达H5亚型AIVHA与NA基因的rFPV，rFPV-12LSH5NA，对10日龄带有H5亚型HPAIV母源抗体的商品鸡进行免疫，17日龄时再用H5亚型AIV全病毒灭活疫苗加强免疫。