黄腐酸与γ-氨基丁酸联合盐胁迫促进单针藻Monoraphidium sp. QLY-1油脂积累相关代谢机制的研究

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目前,以化石燃料为主的传统化石能源的储备越来越少,大量的化石燃料燃烧也给全世界造成了非常严重的环境污染,开发清洁可再生能源成为近些年来的研究热点。生物柴油因其可持续开发性而成为化石燃料的最佳替代型燃料。微藻是一种制备生物柴油的优势原料,能够有效利用光能固定空气中的二氧化碳并将其转化为生物质能。在众多富油微藻中,单针藻属是一种能够在异养与自养培养条件下进行正常的生长代谢以及油脂合成的产油微藻。本研究以单针藻Monoraphidium sp.QLY-1为研究对象,黄腐酸(FA)为诱导子联合盐胁迫(Na Cl)进行诱导培养,通过对单针藻QLY-1中的生物量浓度、油脂产量、叶绿素浓度、碳水化合物含量、蛋白质含量等生理生化表征,以及对活性氧(ROS)、抗氧化酶,包括过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和一氧化氮(NO)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等内源信号分子以及油脂合成相关酶基因的表达水平进行研究与分析。此外,通过化学遗传法,分别探讨了γ-氨基丁酸(GABA)及钙离子(Ca2+)对黄腐酸联合盐胁迫下单针藻QLY-1油脂合成过程中的相关代谢调控机制,具体研究结果如下:(1)构建黄腐酸联合盐胁迫下单针藻Monoraphidium sp.QLY-1高效合成油脂的培养体系。采用25 mg L-1 FA作为主要浓度参数,联合不同浓度Na Cl(0~30g L-1)培养单针藻,通过分析生物量、油脂含量等指标,最终选定在培养第六天时,油脂含量最高(59.53%)的20 g L-1Na Cl浓度作为最优参数,与对照组(40.76%)相比,油脂含量增加了46%;(2)在FA与Na Cl联合作用下,对单针藻Monoraphidium sp.QLY-1中生物量的浓度、油脂的含量、叶绿素的浓度、碳水化合物以及蛋白质的含量进行了分析。与对照组相比,生物量略微下降,油脂含量显著增加,叶绿素浓度显著降低,碳水化合物含量降低,而蛋白质水平则没有显著性变化;(3)在FA与Na Cl联合处理下,单针藻Monoraphidium sp.QLY-1中的抗氧化能力与相关内源响应机制发生变化,ROS快速响应刺激抗氧化酶水平上调,NO水平增加,MAPK蛋白表达水平上调,进而使油脂合成相关基因的表达上调;(4)通过外源添加GABA探究FA联合Na Cl处理下微藻中油脂合成途径的相关代谢调控机制。首先优化GABA浓度,在0.1 m M GABA处理下生物量略有上升,在第24小时,油脂含量为57.89%,与对照组(45.94%)相比增加了1.26倍;(5)在FA耦合Na Cl下,GABA增加了谷胱甘肽(GSH)、GABA含量以及Ca2+水平,同时降低了ROS水平;(6)另外利用化学遗传法对微藻油脂合成途径中涉及的GABA旁路代谢相关信号进行研究。结果显示,油脂含量在添加3-MP后显著降低,Ca2+水平也显著降低;采用Ca2+信号转导抑制剂(EGTA)处理细胞,结果表明,油脂含量以及GABA含量均不同程度下降;此外,对于抗氧化系统的研究发现,微藻受到非生物胁迫时,通过植物激素进行调控使得Ca2+参与旁路代谢进而影响微藻的抗逆性与抗氧化能力,从而促进微藻细胞内的油脂合成与积累。综上,本研究分别从生理生化表观特征以及蛋白和分子水平初步探讨了FA联合Na Cl胁迫促进单针藻Monoraphidium sp.QLY-1油脂积累的机理,得到59.53%的最高油脂含量;另一方面,在FA联合Na Cl作用下,解析了GABA和Ca2+对单针藻积累油脂的作用机制。本研究为利用基因工程策略提高微藻油脂的快速积累以及明晰胁迫条件下微藻抗氧化应激的能力提供了一定的理论基础及实验依据。
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