论文部分内容阅读
目的:
子宫颈癌的病因虽然绝大部分为高危型HPV感染，但并不是所有感染者均会发生癌变，其发生及发展的机制尚不清楚;目前晚期宫颈癌的中位总生存期仅为16.8个月，所有发展阶段的5年总生存率为68％。其侵袭、转移与不良预后密切相关，是导致患者死亡的主要原因。降低宫颈癌的发病率和病死率，一直是各国医疗卫生领域学者的工作重点。因此在临床中应积极寻找宫颈癌的肿瘤特异性抗原及相关性抗原，对于了解宫颈癌的发生、发展及预测预后等具有十分重要的意义，也为寻找晚期宫颈癌的个体化治疗和生物靶向治疗奠定基础。
在前期研究中，通过搜索基因表达综合数据库(Gene Expression Ornnibus,GEO)，筛选出富颈癌发病相关差异基因;并经查阅文献发现在宫颈癌高表达的基因中，黑色素瘤相关抗原A3(melanoma-associated antigen,MAGE-A3)基因在除胎盘和辜丸外的其他正常组织中不表达，但在多种恶性肿瘤中高表达，具有肿瘤特异性。
为了验证我们的推测，本研究通过检索癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库和组织基因组表达(Genotype-Tissue Expression,GTEx)数据库，预测MAGE-A3基因与宫颈癌预后的关系;为了研究MAGE-A3基因与宫颈癌发生发展的关系，在富颈鳞状上皮内病变组织、宫颈癌组织、正常宫颈组织中检测MAGE-A3的表达量。并检测MAGE-A3在宫颈癌细胞系中的表达。然后采用过表达质粒转染宫颈癌细胞构建MAGE-A3过表达细胞系，通过siRNA转染构建宫颈癌细胞构建MAGE-A3沉默细胞系，进行一系列细胞功能实验观察MAGE-A3的表达水平是否对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭产生影响。此外，进一步探讨了MAGE-A3影响宫颈癌发病的可能作用机制，并通过构建免疫缺陷小鼠成瘤实验进行体内动物实验对体外细胞学实验的结果进行验证。
方法:
第一章:利用检索在线TCGA和GTEx数据库，预测MAGE-A3的表达水平对宫颈癌患者预后的影响;选取了宫颈鳞状上皮内病变组织(C时III)40例、富颈癌组织90例、正常宫颈组织40例，通过免疫组化、PCR、Western blot方法检测MAGE-A3的表达，并分析其与临床病理特征及与预后的关系;
第二章:选择人宫颈上皮永生化细胞系En而E6E7以及宫颈癌细胞系Hela、Siha、C33A作为研究对象，通过qRT-PCR及Western blot检测MAGE-A3在宫颈癌细胞系中的表达情况。
第三章:采用pcDNA3.1-MAGE-A3转染宫颈癌细胞构建MAGE-A3过表达细胞系，通过si-MAGE-A3转染构建宫颈癌细胞构建MAGE-A3沉默细胞系，并通过qRT-PCR及Western blot鉴定转染效果;通过CCK8实验、平板克隆实验，观察MAGE-A3对宫颈癌细胞增殖能力的影响;通过划痕实验、Transwell实验，观察MAGE-A3对宫颈癌细胞侵袭和迁移的影响。
第四章:分别在MAGE-A3过表达和沉默细胞株中，通过qRT-PCR和We stem blot检测MAGE-A3对宫颈癌细胞中EMT标志物的影响;分别在MAGE-A3过表达和沉默细胞株中，检测Wnt通路相关蛋白的表达变化。
第五章:分别将HeLa细胞和SiHa细胞及转染后两种细胞移植于裸鼠皮下，注射后每7d测量1次肿瘤体积，注射28d后从裸鼠体内分离出肿瘤，观察肿瘤体积情况;免疫组化检测各组移植瘤中EMT标记物的表达情况。
结果:
第一章:与正常宫颈组织及宫颈鳞状上皮内病变组织（CINIII)比较，MA GE-A3在宫颈癌组织中高表达;MAGE-A3在高表达组的总体生存率低于低表达组，并与临床分期，分级及淋巴结转移和HPV感染相关，差异均显著(p＜0.01)。
第二章:与Endl?6E7相比，MAGE-A3在宫颈癌细胞中呈现高表达，差异具有统计学意义。(p＜0.05)，且MAGE-A3在Hela中表达最高，在Siha中表达最低。
第三章:pcDNA3.1-MAGE-A3转染Siha细胞后显著上调了细胞中MAGEA3的表达;si-MAGE-A3转染Hela细胞后有效沉默了细胞中MAGE-A3的表达。CCK8测定结果显示，与si-con组相比，si-MAGE-A3转染后48h、72h和96h的HeLa细胞OD值明显降低。si-MAGE-A3组的克隆数量也少于si-con组。过表达的MAGE-A3SiHa细胞的OD值较对照组明显升高。与对照组相比，MAG E-A3在SiHa细胞中过表达显著增加了克隆数量。
第四章:在HeLa细胞中下调MAGE-A3后，N-cadherin和Vimentin的蛋白质表达水平下降，E-cadherin显著增加;在SiHa细胞中上调MAGE-A3后，N-cadherin和Vimentin的蛋白质表达水平增加，E-cadherin蛋白水平显著降低。M AGE-A3的下调显著降低Hela细胞中β-catein、C-Myc和CyclinD1的表达。MA GE-A3的过表达明显增加Siha细胞中。β-catein、C-Myc和CyclinD1的水平。
第五章:si-con组的裸鼠肿瘤明显大于si-MAGE-A3组，且增长速度较其快;注射SiHa细胞MAGE-A3组的裸鼠肿瘤大于Vector组，且增长速度也较其快，差异有统计学意义(p＜0.05)。在沉默MAGE-A3组的肿瘤组织中，E-cadherin表达增加，Vimentin蛋白质表达下降;在过表达MAGE-A3组的组织中，E-ca dherin蛋白表达下调，Vimentin蛋白表达上调。
结论:
MAGE-A3基因参与了宫颈癌的发生发展过程，在宫颈癌组织和细胞中高表达，与患者的总生存期呈负相关，说明MAGE-A3的表达可提示患者的预后;该基因促进宫颈癌细胞的增殖、侵袭和迁移，并可能通过激活Wnt信号通路促进EMT并影响宫颈癌细胞的生物学行为;其在体内可能通过EMT调控宫颈癌肿瘤的增长。MAGE-A3基因在宫颈癌细胞中上调，并可能调控Wnt信号通路和EMT的过程。MAGE-A3在宫颈癌中的过表达可能参与了宫颈癌的进程，对于进一步了解宫颈癌生物学行为及判断预后有很重要的临床应用价值。
子宫颈癌的病因虽然绝大部分为高危型HPV感染，但并不是所有感染者均会发生癌变，其发生及发展的机制尚不清楚;目前晚期宫颈癌的中位总生存期仅为16.8个月，所有发展阶段的5年总生存率为68％。其侵袭、转移与不良预后密切相关，是导致患者死亡的主要原因。降低宫颈癌的发病率和病死率，一直是各国医疗卫生领域学者的工作重点。因此在临床中应积极寻找宫颈癌的肿瘤特异性抗原及相关性抗原，对于了解宫颈癌的发生、发展及预测预后等具有十分重要的意义，也为寻找晚期宫颈癌的个体化治疗和生物靶向治疗奠定基础。
在前期研究中，通过搜索基因表达综合数据库(Gene Expression Ornnibus,GEO)，筛选出富颈癌发病相关差异基因;并经查阅文献发现在宫颈癌高表达的基因中，黑色素瘤相关抗原A3(melanoma-associated antigen,MAGE-A3)基因在除胎盘和辜丸外的其他正常组织中不表达，但在多种恶性肿瘤中高表达，具有肿瘤特异性。
为了验证我们的推测，本研究通过检索癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库和组织基因组表达(Genotype-Tissue Expression,GTEx)数据库，预测MAGE-A3基因与宫颈癌预后的关系;为了研究MAGE-A3基因与宫颈癌发生发展的关系，在富颈鳞状上皮内病变组织、宫颈癌组织、正常宫颈组织中检测MAGE-A3的表达量。并检测MAGE-A3在宫颈癌细胞系中的表达。然后采用过表达质粒转染宫颈癌细胞构建MAGE-A3过表达细胞系，通过siRNA转染构建宫颈癌细胞构建MAGE-A3沉默细胞系，进行一系列细胞功能实验观察MAGE-A3的表达水平是否对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭产生影响。此外，进一步探讨了MAGE-A3影响宫颈癌发病的可能作用机制，并通过构建免疫缺陷小鼠成瘤实验进行体内动物实验对体外细胞学实验的结果进行验证。
方法:
第一章:利用检索在线TCGA和GTEx数据库，预测MAGE-A3的表达水平对宫颈癌患者预后的影响;选取了宫颈鳞状上皮内病变组织(C时III)40例、富颈癌组织90例、正常宫颈组织40例，通过免疫组化、PCR、Western blot方法检测MAGE-A3的表达，并分析其与临床病理特征及与预后的关系;
第二章:选择人宫颈上皮永生化细胞系En而E6E7以及宫颈癌细胞系Hela、Siha、C33A作为研究对象，通过qRT-PCR及Western blot检测MAGE-A3在宫颈癌细胞系中的表达情况。
第三章:采用pcDNA3.1-MAGE-A3转染宫颈癌细胞构建MAGE-A3过表达细胞系，通过si-MAGE-A3转染构建宫颈癌细胞构建MAGE-A3沉默细胞系，并通过qRT-PCR及Western blot鉴定转染效果;通过CCK8实验、平板克隆实验，观察MAGE-A3对宫颈癌细胞增殖能力的影响;通过划痕实验、Transwell实验，观察MAGE-A3对宫颈癌细胞侵袭和迁移的影响。
第四章:分别在MAGE-A3过表达和沉默细胞株中，通过qRT-PCR和We stem blot检测MAGE-A3对宫颈癌细胞中EMT标志物的影响;分别在MAGE-A3过表达和沉默细胞株中，检测Wnt通路相关蛋白的表达变化。
第五章:分别将HeLa细胞和SiHa细胞及转染后两种细胞移植于裸鼠皮下，注射后每7d测量1次肿瘤体积，注射28d后从裸鼠体内分离出肿瘤，观察肿瘤体积情况;免疫组化检测各组移植瘤中EMT标记物的表达情况。
结果:
第一章:与正常宫颈组织及宫颈鳞状上皮内病变组织（CINIII)比较，MA GE-A3在宫颈癌组织中高表达;MAGE-A3在高表达组的总体生存率低于低表达组，并与临床分期，分级及淋巴结转移和HPV感染相关，差异均显著(p＜0.01)。
第二章:与Endl?6E7相比，MAGE-A3在宫颈癌细胞中呈现高表达，差异具有统计学意义。(p＜0.05)，且MAGE-A3在Hela中表达最高，在Siha中表达最低。
第三章:pcDNA3.1-MAGE-A3转染Siha细胞后显著上调了细胞中MAGEA3的表达;si-MAGE-A3转染Hela细胞后有效沉默了细胞中MAGE-A3的表达。CCK8测定结果显示，与si-con组相比，si-MAGE-A3转染后48h、72h和96h的HeLa细胞OD值明显降低。si-MAGE-A3组的克隆数量也少于si-con组。过表达的MAGE-A3SiHa细胞的OD值较对照组明显升高。与对照组相比，MAG E-A3在SiHa细胞中过表达显著增加了克隆数量。
第四章:在HeLa细胞中下调MAGE-A3后，N-cadherin和Vimentin的蛋白质表达水平下降，E-cadherin显著增加;在SiHa细胞中上调MAGE-A3后，N-cadherin和Vimentin的蛋白质表达水平增加，E-cadherin蛋白水平显著降低。M AGE-A3的下调显著降低Hela细胞中β-catein、C-Myc和CyclinD1的表达。MA GE-A3的过表达明显增加Siha细胞中。β-catein、C-Myc和CyclinD1的水平。
第五章:si-con组的裸鼠肿瘤明显大于si-MAGE-A3组，且增长速度较其快;注射SiHa细胞MAGE-A3组的裸鼠肿瘤大于Vector组，且增长速度也较其快，差异有统计学意义(p＜0.05)。在沉默MAGE-A3组的肿瘤组织中，E-cadherin表达增加，Vimentin蛋白质表达下降;在过表达MAGE-A3组的组织中，E-ca dherin蛋白表达下调，Vimentin蛋白表达上调。
结论:
MAGE-A3基因参与了宫颈癌的发生发展过程，在宫颈癌组织和细胞中高表达，与患者的总生存期呈负相关，说明MAGE-A3的表达可提示患者的预后;该基因促进宫颈癌细胞的增殖、侵袭和迁移，并可能通过激活Wnt信号通路促进EMT并影响宫颈癌细胞的生物学行为;其在体内可能通过EMT调控宫颈癌肿瘤的增长。MAGE-A3基因在宫颈癌细胞中上调，并可能调控Wnt信号通路和EMT的过程。MAGE-A3在宫颈癌中的过表达可能参与了宫颈癌的进程，对于进一步了解宫颈癌生物学行为及判断预后有很重要的临床应用价值。