一 研究背景: 肝脏是人体重要的器官,具有生物合成、生物转化、分泌代谢和解毒等多种功能,是人体最大的“化学工厂”。各种原因一旦造成肝细胞的大量破坏,将出现肝功能的衰竭,导致机体代谢的严重紊乱和毒性物质的大量堆积;两者又反过来进一步加重肝损害,加剧肝细胞的坏死,并影响残存肝细胞的再生,从而形成肝功能衰竭的恶性循环。人工肝(artificial liver, AL)的研究出发点就是寄希望采用人工解毒、代偿肝脏代谢及合成功能的方法,打破上述恶性循环,稳定肝衰竭病人的内环境,为具有较强再生能力的肝细胞再生或为进一步肝移植而争取时间、创造条件。 自1956年Sorrention首次提出“人工肝脏”概念并证明新鲜肝组织匀浆能代谢酮体、巴比妥和氨以来,人们一直希望采用体外肝脏支持的方法来代替病人衰竭的肝脏功能,为其等待肝移植或自身肝再生争取时间、创造条件。长期以来,用于人工肾(artificial kidney)的血液净化技术就被移植作为AL的主要方法,试图通过机械解毒作用来减少肝衰竭病人体内越积越多的毒性物质。AL的近50年研究历史证明,各种单纯以解毒为主要功能的AL方法和技术难以代偿肝功能衰竭时的肝脏功能,只有以肝细胞为主要生物材料的BAL才能具有真正意义上的“肝脏功能”,为肝功能衰竭病人提供可靠的活性肝功能支持。当今,几乎所有的BAL都是以培养肝细胞为基础的,其核心有两个:一是:体外培养的、具有活性和功能的并能发挥正常人肝脏大部分功能的“肝细胞”;二是:可供肝细胞培养或放置并能与病人血液接触,允许双方进行充分交换的半透“膜”(semipermeable membrane)即:进行肝功能支持的装置-生物反应器(bioreactor)。两者相互依存,共同完成BAL的生物功能。 生物反应器是体外AL系统中肝细胞与急性肝衰竭病人血液/血浆进行物质交换、发浙江大学医学院六博士学位疮文人肝细胞/橄孔聚丙稀生肠杂化界面构建的研究*摘要挥BAL生物转化、代谢支持作用的关键部位,作为体外BAL支持系统的核,‘,在设计上必须提供两大功能:一是:提供一个能理想表达肝细胞分化功能的良好环境。二是:提供肝细胞与病人血液或血浆之间相互作用、进行物质交换的良好生理界面(physiologicinterface)I’,’3,’4]。具体而言生物反应器的设计和构建应当满足一下基本条件和要求:双向物质传输、保障肝细胞的活性与功能和易于放大[l 51,然而目前临床实践中使用的生物反应器并不能完全满足这两大功能。如何更好的保存肝细胞的活力和功能是BAL肝细胞培养和生物反应器设计中需要首先加以考虑的问题,作为生物反应器的生物材料对肝细胞的郭附、增殖和生物活性有着重要的影响,可见,肝细胞/生物反应器聚合物材料界面是生物反应器设计和构建的关键因素。因此,构建具有良好生物相容性的肝细胞/聚合物生物相容杂化界面是设计和构建BAL生物反应器的关键核心。 反应器膜材料的基本要求为:双向物质交换、生物相容性和具备良好的理化特性【”,,“】。聚丙烯(PolyPr叩ylene,PP)由于具有良好的力学性能、易加工成型、具有良好的物理学韧性和价格低廉而被广泛地用作各种塑料包装业和制成中空纤维管用于污水的过滤,但其严重的不足是有较高的疏水性而导致PP材料表面与细胞的相容性不好,限制了在生物医学领域中的应用。 生物材料表面的物理化学性质对细胞与材料间的相互作用起着非常重要的作用,它的改变可以影响细胞附着条件并调整细胞内信号,从而对细胞的私附、增殖和生物活性有着重要的影响【‘’,‘7一’”l。化学聚合接枝技术可以在保持材料本体的物理力学性能的同时,通过在材料表面引进化学键结合的功能性分子基团,改变材料表面的性能,提高生物材料的生物相容性并进而对在其表面生长的细胞产生增殖和代谢活性的影响[’“一2’】。因此,通过化学接枝改性技术,可以改变PP表面的化学基团而不影响其物理力学特性,从而改变PP的生物相容性,无疑将增加其在生物医学领域中的应用。二研究目的: 为了牙,J用国内成熟的pP中空纤维管(hollow fibers pipe)研制有自主知识产权的、高活性的生物相容性BAL生物反应器,我们以微孔孔径为0.2林m,分子截流量(cut一off)为50一lookD的微孔聚丙烯超滤膜(mieropore polypropylene semipermeable ultrafiltrationmembrane,M即)平面薄膜为研究模型,利用光化学接枝聚合改性技术,在MPP表面通过化学键的形式接枝亲水性基团一丙烯酞胺(ac州amide,AAm)基团形成接枝改性浙江大学医学院*博士学位论文人肝细胞/徽孔聚丙榨生物杂亿界面构建的研究六摘要MPP(Modified MPP),以期构建出良好的人肝细胞/聚丙烯生物相容性杂化界面,为进一步用聚丙烯中空纤维管设计和构建BAL生物反应器莫定了良好的先期基础。三实脸方法:1 Modi行edMPP的剑备和表征:1.,Mpp的化学接枝改性: MPP的接枝改性包括光氧化、接枝聚合、漂洗三个步骤。光氧化:MPP浸于30%HZq石英聚合管,250W高压汞灯辐照,石英管gr/min旋转,50℃x4h后去离子水漂洗除去MPP膜表面游离的HZOZ分子。接枝聚合:氧化后的MPP浸于1 omls%AAm单体溶液石英聚合管中,除氧充氮,加lml 0.015M硫酸亚铁按溶液,30℃x3Omin,得