论文部分内容阅读
禽鹦鹉热嗜性衣原体是一种重要的人畜共患病,随着我国集约化养殖业的不断发展,禽鹦鹉热嗜性衣原体的感染呈现上升的趋势,本病的流行已严重阻碍养殖业的发展和威胁人类健康。目前尚未有商品化的禽鹦鹉热嗜性衣原体疫苗上市,因此,开发高效、价廉的新型疫苗势在必行。已有研究证明衣原体Omp-1基因编码的主要外膜蛋白(Major Outer Membrane Protein,MOMP)是其主要保护性抗原成分且具有种属特异性,本实验克隆Omp-1基因并构建了pcDNA3-1-Omp-1DNA疫苗,同时配合重组主要外膜蛋白和佐剂CpG免疫SPF鸡旨在探讨增强鹦鹉热嗜性衣原体DNA疫苗的途径。
方法:
①根据禽鹦鹉热嗜性衣原体Omp-1基因序列,设计了一对含有EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ酶切位点的引物。利用聚合酶链反应(PCR)扩增禽鹦鹉热嗜性衣原体Omp-1基因,用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切该片段,回收得到含有以上两个酶切位点粘端的Omp-1基因,将此基因克隆至相同酶切回收后的pcDNA3.1(+)真核表达载体中。
②纯化重组真核表达质粒pcDNA3.1-Omp-1,脂质体介导方法转染哺乳动物细胞BHK<,21>,RT-PCR和Western-blot方法鉴定目的基因在BHK<,21>细胞中的瞬时表达。
③根据文献报道合成了一条禽用硫代磷酸化修饰的CpG序列5’TCGTCGTTTTGTCGTITTGTCGTT3’(命名为CpG2006)。36只SPFg鸟随机分成6组后,将pcDNA3.1-Omp-1与r-MOMP、CpG以不同组合进行两次免疫,以空质粒、免疫佐剂组做对照。二免后14天采血,以间接酶联免疫吸附试验(iELISA)和MTT法T淋巴细胞增殖(LTT)试验分别检测特异性抗体和淋巴细胞增值水平。二免14天后进行攻毒,攻毒后第7天采集泄殖腔棉拭子,免疫荧光抗体检测SPF鸡排除衣原体的状况;攻毒18天后,宰杀所有的SPF鸡,采集脾脏、肺脏,免疫组化染色观察清除禽鹦鹉热嗜性衣原体的状况。
结果:
①获得重组质粒pcDNA3.1- Omp-1。经PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。
②RT-PCR和Western-blot证实构建的重组表达质粒pcDNA3.1- Omp-1能够在哺乳动物细胞中表达:MOMP蛋白。
③单独免疫r-MOMP能够诱发高水平的抗体,单独免疫pcDNA3.1- Omp-1能诱导中等水平的淋巴细胞增值。免疫DNA疫苗的鸡具有较好的衣原体清除效果,配合CpG2006免疫DNA疫苗组虽然只诱导了低水平的特异性抗体和中等水平T淋巴细胞增值,但其清除衣原体的效果最好。
综上所述,本研究成功构建了禽鹦鹉热嗜性衣原体pcDNA3.1- Omp-1DNA疫苗,证实pcDNA3.1-Omp-1,疫苗具有较好的衣原体清除效果。CpG2006与DNA疫苗配合较单独免疫DNA疫苗组具有更好的衣原体清除效果,CpG2006具有增强鹦鹉热嗜性衣原体DNA疫苗的效果。