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硒是人体必不可少的微量元素之一。我国有70%左右的地区缺硒,缺硒会导致多种疾病从而危害人体健康。人们可通过补硒来提高免疫力,预防疾病等。灵芝是药食兼用的大型真菌,与其他食用菌相比,对硒的富集能力更强。若能把合适的外源硒富集到灵芝中转化为有机硒,可进一步提高灵芝的营养和经济价值。本文用不同浓度的亚硒酸钠(Na2SeO3)溶液对斜面培养的赤灵芝(简写为C)、红灵芝(简写为R)、黑灵芝(简写为H)和紫灵芝(简写为Z)进行富硒驯化,筛选出适宜灵芝菌丝生长的Na2SeO3浓度(0.05 g/L),并在添加外源硒的袋料栽培中得到出芝率较高的两灵芝品种C和R。将接满上述两灵芝菌丝的椴木分别置于葡萄林下土壤中进行仿野生栽培。每隔7天共8次对葡萄林下土壤喷施0.05 g/LNa2SeO3溶液,研究外源硒对土壤和灵芝的硒含量、土壤酶活性、土壤可培养微生物数量、细菌群落多样性及灵芝品质的影响,以期为富硒灵芝的开发利用提供理论依据。主要研究结果如下:1.将四种浓度水平的 Na2SeO3(0.01 g/L、0.05 g/L、0.1 g/L、0.5 g/L)加入培养基质中并对四种灵芝进行斜面培养。结果表明:与不加硒对照相比,当Na2SeO3浓度≤0.05 g/L时,四种灵芝菌丝均爬满试管,菌丝洁白健壮,且Na2SeO3浓度=0.05 g/L时生长状况最好;当Na2SeO3浓度=0.1 g/L时,四种灵芝菌丝生长都受到一定程度的抑制,表现为菌丝生长状况≤60%;当Na2SeO3浓度=0.5 g/L时,对四种灵芝菌丝生长的抑制作用最强,表现为菌丝不生长。说明低浓度的Na2SeO3对灵芝菌丝生长有促进作用,而高浓度的Na2SeO3则有较强的抑制作用。0.05 g/L为斜面培养时灵芝生长最适宜的Na2SeO3浓度。2.以木屑和米糠为主要基质,并按(0.01、0.05 gNa2SeO3/kg袋料基质)两个硒浓度对灵芝进行袋料栽培。实验结果表明:与不加硒处理相比,在添加0.01 gNa2SeO3/kg袋料基质时,C和R的出芝率升高且均≥ 80%,Z和H的出芝率≤26%;添加0.05 gNa2SeO3/kg袋料基质时,四种灵芝的出芝率均下降,但C和R的出芝率仍≥ 80%,H和Z的出芝率≤16%。可见,灵芝的适宜硒浓度为0.05 g Na2SeO3/kg袋料基质,可耐受较高硒浓度的两灵芝品种为C和R。3.在葡萄林下对C和R进行椴木栽培时,用0.05g/LNa2SeO3喷施林下土壤,设置无硒处理赤灵芝(简写为CKC),加硒处理赤灵芝(简写为SC),无硒处理红灵芝(简写为CKR),加硒处理红灵芝(简写为SR)四个处理,加硒处理共喷施8次,最终使得SC、SR处理土壤总硒含量本底值为1.38 mg/kg、1.61 mg/kg,达到富硒土壤的标准(土壤中硒量>0.4 mg/kg)。成熟期SC和SR子实体的硒含量均显著高于相应不加硒对照处理(P<0.05),其总硒含量分别为16.5 mg/kg、4.06 mg/kg,有机硒含量分别为13.09 mg/kg、3.81 mg/kg,有机硒含量占总硒含量比超过80%,均超过广西富硒农作物标准中富硒食用菌的硒水平(0.15-2 mg/kg),即可称为富硒灵芝,且C对硒的生物富集系数比R高4倍,说明C对硒的富集能力更强。4.与CK C和CK R处理相比,SC和SR处理的灵芝子实体中粗蛋白、多糖、三萜化合物的含量均显著提高,而还原糖含量显著降低(P<0.05)。SC和SR的粗蛋白含量分别提高22.2%、35.7%,多糖含量分别提高53.9%、46.9%,三萜化合物含量分别提高17.31%、15.25%;还原糖含量分别降低62.4%、44.15%。说明加硒处理促进粗蛋白、多糖和三萜化合物的积累,但对还原糖的产生有抑制作用。两种灵芝的总硒和有机硒含量与粗蛋白、多糖、三萜化合物之间均呈极显著正相关(P<0.01)。5.与CK C和CK R处理相比,SC和SR子实体中全氮和全磷含量显著提高,全钾含量显著降低(P<0.05);灵芝总硒和有机硒含量与全氮、全磷含量间均呈极显著正相关,而与全钾含量间呈极显著的负相关(P<0.01);土壤蔗糖酶、酸性磷酸酶和脲酶的活性则显著降低(P<0.05)。6.除SR处理灵芝栽培土壤中真菌数量与CK R处理间差异不显著外,SC和SR处理土壤中可培养细菌、放线菌、真菌的数量都分别比CKC和CKR处理显著降低(P<0.05)。7.对四种处理灵芝栽培土壤中细菌16S rDNA进行PCR-DGGE分析,结果表明:不同处理对灵芝土壤细菌群落产生不同影响。从DGGE图谱上看,外源硒处理后,一些原有的优势条带减弱或消失,一些新条带出现。如SC处理中条带1亮度减弱,条带8是新出现的;而SR处理中,条带2、4、5、6消失,条带3、7、9新出现。说明外源硒处理和灵芝处理后,一些原有的优势细菌群落衰减或消失,而原先非优势细菌适应高硒浓度而大量繁殖,发展成为优势群落。加硒和灵芝土壤中细菌丰富度、多样性指数及均匀度指数均下降。土壤细菌丰富度和Shannon-Wiener指数大小顺序为:CK C>CKR>SR>SC;Pielou均匀度指数变化趋势为:CK R>CKC>SC>SR。8.与CKC和CKR处理相比,SC和SR处理灵芝干重与菌盖厚度显著增加,变化趋势为:SR>SC>CKC>CKR;SC处理的菌盖面积和菌柄高度与CKC相比差异均不显著,SR则比CK R处理显著提高(P<0.05)。综上所述,通过对斜面培养基质添加Na2SeO3使得终浓度为0.05 g/L,袋料栽培基质中添加0.05 g Na2SeO3/kg栽培基质为本研究灵芝最适宜外源硒添加水平,上述硒浓度下出芝率高的为赤灵芝和红灵芝。葡萄林下椴木栽培土壤中喷施0.05 g/L Na2SeO3溶液处理后,赤灵芝和红灵芝子实体中硒含量比CK C和CK R处理显著提高(P<0.05),达到富硒灵芝水平。同时,土壤硒含量、灵芝的营养和药用成分均显著提高(P<0.05)。本研究为富硒灵芝的开发和推广运用提供理论依据。