苹果属山定子MbICE3基因的克隆及功能分析

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植物在生长发育过程会受到各种逆境胁迫影响,面对胁迫时植物会采取不同的方式进行响应,其基本机制是调控相应基因表达,导致植物代谢通路发生转变,抗逆物质合成与积累,使植物对逆境的耐受性大大提高。低温是植物在自然界面临的主要胁迫因素,目前已成为限制中国果树产业可持续发展的主要问题之一,提高抗寒性是解决上述问题的主要方法。本研究以山定子为研究对象,在分离鉴定ICE转录因子的基础上,系统分析MbICE3基因在植株不同部位的表达特性,并对森林草莓遗传转化体系进行优化,推测MbICE3基因与植物抗寒性之间的关系。研究结果如下:1.通过基因克隆技术得到ICE转录因子MbICE3基因,该基因全长1560 bp,编码519个氨基酸,由该基因翻译的蛋白质序列中含有b HLH保守结构域,将山定子MbICE3蛋白和其他12种作物进行多序列比对,发现其与苹果Md ICE3蛋白亲缘关系最近。2.瞬时转化洋葱表皮细胞发现,MbICE3定位在细胞核中。3.q-PCR结果发现MbICE3基因在山定子不同部位的表达量有所差异,同一部位的处理时间不同表达量也不同。MbICE3基因在新叶和根中高表达,而在老叶和茎中低表达。选择该基因在山定子高表达的部位进行分析,发现MbICE3基因的表达量在24 h内的低温、高盐、干旱、高温四种胁迫处理下表现出先上升后下降的趋势,同时发现进行低温和干旱胁迫时MbICE3基因的响应格外强烈。新叶中该基因经过低温、高盐、干旱、高温四种胁迫后,分别在4 h、8 h、4 h、12 h时达到峰值,在根中分别在8 h、12 h、4 h、8 h时达到峰值。4.优化森林草莓‘Hawaii 4’再生体系和遗传转化体系结果如下:(1)筛选激素浓度组合结果表明,当6-BA质量浓度为3.0 mg/L,IBA质量浓度为0.1 mg/L时,草莓再生率达到最高,再生率在85%以上。(2)叶片和叶柄的分化能力随叶龄增加而提高,叶片和叶柄在49 d时不定芽的再生能力最强,再生率分别为88.4%和83%;超过49 d时,出现黄化、失水干枯等现象,再生率及平均再生芽数均显著下降,并发现叶片的再生能力要略高于叶柄。(3)通过对抗生素浓度进行梯度试验,结果表明,选用25 mg/L Kana和300mg/L Cef时,筛选效果最好。5.通过对再生体系和遗传转化体系的优化,将MbICE3基因转入森林草莓‘Hawaii 4’中,获得转基因草莓。经过对MbICE3基因的表达量分析,选用3个相对表达量较高株系,然后与野生型株系同时进行-6 oC低温处理6 h,发现转基因草莓和野生型草莓都出现了不同程度的冻伤,经7 d的常温恢复后,野生型草莓大部分干枯死亡,而转基因草莓虽有冻伤,但仍正常生长。对野生型和转基因草莓进行生理指标测定发现,相较于野生型草莓,转基因草莓的可溶性糖、叶绿素、CAT和POD的含量均显著提高,而MDA含量和相对电导率有明显下降,证明转入MbICE3基因的草莓植株抗寒能力得到提高。综上所述,我们推测MbICE3基因参与了森林草莓低温胁迫转导,提高了草莓抗寒性。为ICE转录因子在低温环境下响应胁迫奠定了分子基础,同时推动了抗寒草莓育种的进程。
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