青蛤是我国重要的养殖经济贝类,受养殖密度、残饵等其他因素等影响环境,可能导致青蛤产量降低,品质和效益下降。氨氮是养殖水环境中重要的环境胁迫因子,可能影响滩涂贝类。目前,对青蛤的研究多集中在环境胁迫对青蛤存活影响以及青蛤免疫相关基因的分子标记筛选等方面,关于青蛤氨氮胁迫环境下生理状态的变化还尚未见报道。因此,研究青蛤免疫相关酶活力变化与基因组织表达量变化,了解氨氮环境下青蛤响应机制,有助于青蛤养殖业的健康持续发展。本研究的具体内容如下:1、本章实验旨在评估氨氮对青蛤的毒性和胁迫后恢复情况。利用前期实验得出的青蛤TAN 48 h LC50确定实验组并通过测定青蛤在急性氨氮胁迫48 h内以及胁迫后恢复48 h的情况下肝胰腺组织中有关非特异性免疫酶活性,包括碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）和溶菌酶（LZM）的应激变化。结果如下:随着TAN胁迫浓度的增加,胁迫后AKP活性呈先上升后下降趋势,而胁迫恢复后的AKP活性呈上升趋势。胁迫恢复后的AKP活性显着高于对照组。胁迫后恢复后T1（20 mg/L）和T2（40 mg/L）的ACP活性高于对照组,而胁迫后恢复后T3（60 mg/L）、T4（80 mg/L）和T5（100 mg/L）的ACP活性显着高于对照组。胁迫后T1和T2的LZM活性显着高于对照组,而胁迫后T3、T4和T5 LZM活性显着低于对照组。总体而言,胁迫于低水平TAN（≤40 mg/L）的青蛤中的ACP和LZM可以完全恢复到正常水平。然而,48 h的恢复期似乎不足以补偿暴露于高水平TAN（＞40 mg/L）的青蛤中的AKP、ACP和LZM活性。综上,我们评估了急性氨氮胁迫和胁迫后恢复对青蛤非特异性免疫的影响,结果可能有助于揭示免疫反应和氨氮毒性之间的潜在关系。2、本章实验检测长期慢性氨氮胁迫下青蛤肝胰腺组织不同时间的免疫酶活性表达来探究氨氮对青蛤的毒性情况。利用上章实验得出的TAN浓度:8.07mg/L来胁迫青蛤768h（32 d）,并取肝胰腺组织样品测定ACP、AKP、LZM和超氧化物歧化酶（SOD）的酶活变化情况。结果如下:随着时间的延长,ACP酶活性总体呈现上升的变化趋势,在第6 h时,表达量稍微下降,且降低至最小值,与对照组相比无明显差异（P＞0.05）;第768 h（32 d）升高至最大值,与对照组两者差异显著（P＜0.05）。AKP酶活性总体呈现先升后降趋势,且在第6 h时AKP酶活力显著升高到最大值,与对照相比发生显著的上调（P＜0.05）;在持续胁迫12 h后,实验组AKP的酶活力表达量相比前6 h发生了下降,但仍显著高于对照组（P＜0.05）;24 h、384 h（16 d）、768 h（32 d）均与对照组差异显著（P＜0.05）。溶菌酶（LZM）活性总体呈现波浪形变化趋势,在第3 h至192 h时,实验组表达量明显高于对照组,均与对照组有显著的上调（P＜0.05）;其中,24 h实验组酶活最显著（P＜0.05）。超氧化物歧化酶（SOD）活性总体呈现先升后降的变化趋势,第3 h时,实验组表达量升高,但与对照相比发生不显著的上调（P＞0.05）,第6 h时,实验组SOD酶活力表达与第3 h时变化不明显;直至第96 h时SOD活性升至最高点,与对照组差异显著（P＜0.05）。总体而言,青蛤在768 h（32 d）的氨氮长期胁迫下,会导致青蛤肝胰腺组织中ACP和AKP活性总体上升且变化显著,同时氨氮长期胁迫会诱导LZM活性的表达,以及SOD活力的提高。说明在长时间的氨氮胁迫下青蛤受到刺激使其免疫酶活性受到影响,增强了溶菌能力和抗氧化能力。综上,这为探究慢性氨氮胁迫与青蛤免疫酶活的关系提供了理论基础。3、本章实验目的是为探究氨氮胁迫后副溶血性弧菌侵染对青蛤非特异性免疫的影响,利用浓度为1×10~7CFU/m L的副溶血性弧菌侵染氨氮胁迫768 h的青蛤,检测0至144h过程中青蛤肝胰腺组织的免疫酶活和非特异性免疫相关基因白介素（Interleukin-17-3,IL-17-3）以及干扰素诱导跨膜蛋白（Interferon-induced helicase C domain-containing protein 1,IFITM1）)的表达情况。结果如下,青蛤肝胰腺组织的ACP酶活性呈现先降后升趋势,在6 h时,降至最低,但差异不显著（P＞0.05）;第12 h时升至最高值,差异显著（P＜0.05）,第48 h、96 h和120 h时实验组均明显升高,相比对照组发生显著上调（P＜0.05）。AKP酶活性总体呈现上升的变化趋势,12 h、48 h和96 h时实验组中AKP酶活力明显升高,且第96 h时升高到最大值,与对照相比发生显著的上调（P＜0.05）;LZM酶活性总体呈波浪形变化趋势,在第6 h时,实验组中青蛤体内LZM酶活力明显升高,与对照相比发生显著的上调（P＜0.05）;在第96 h时,表达最显著（P＜0.05）;在持续胁迫144 h（7d）后,实验组LZM的酶活力仍显著高于对照组（P＜0.05）。SOD酶活性总体呈现上升的变化趋势,对照组和实验组中青蛤体内SOD酶活力在第48 h时,实验组表达量升高至最大值,与对照相比发生显著的上调（P＜0.05）,其次变化显著的是第120 h,总体每个时间点的表达都与对照组存在显著差异,说明SOD的酶活性变化强烈。在IL-17-3和IFITM1基因的时序性表达量方面,随时间的延长,总体与对照组存在差异,第3 h、48 h、96 h和144 h时,IL-17-3 m RNA表达高于对照组,并有显著差异（P＜0.05）,其中48 h表达量最高。IFITM1m RNA表达量从6 h时开始变化显著（P＜0.05）,直到第48 h时表达量最高（P＜0.05）,总体除3 h外其余时间组都与对照组发生明显上调（P＜0.05）。总体而言,副溶血性弧菌侵染后,导致青蛤肝胰腺组织中ACP活性于12 h、48 h、96 h和120 h显著上升（P＜0.05）,AKP活性于12 h、48 h和96 h时显著上调（P＜0.05）,LZM活性的波浪形变化以及SOD的显著上调。结合三种水解酶一种抗氧化酶的活性变化来看,弧菌的侵染会导致青蛤肝胰腺的体液免疫受到强烈影响。且在副溶血性弧菌的侵染下,IL-17-3和IFITM1基因均有表达,且总体显著上调（P＜0.05）,说明这两个基因都参与了在青蛤肝胰腺组织中的免疫防御应答。4、本章实验为探究氨氮胁迫对青蛤非特异性免疫相关的IL-17-3和IFITM1基因的功能,利用RACE技术克隆两个基因的全长c DNA序列和检测实时荧光定量表达来评估氨氮毒性与免疫基因的关系。结果如下:IL-17-3基因的全长c DNA序列共1027 bp,包含603bp开放阅读框,编码200个氨基酸,系统进化树结果表明青蛤与其他瓣鳃纲IL-17-3基因同源性高,说明其进化保守。IFITM1基因的全长c DNA序列共2434 bp,包含2301 bp的开放阅读框,共编码714个氨基酸,系统进化树结果表明青蛤与瓣鳃纲同源性较高,进化保守。荧光定量结果显示,长期慢性氨氮胁迫下,青蛤IL-17-3基因在6 h时表达量最高,显著高于对照组（P＜0.05）,而其他时间点的表达量均高于对照组但不显著（P＜0.05）。青蛤IFITM1基因在192 h时表达量最高,显著高于对照组（P＜0.05）,其他时间表达量同样显著（P＜0.05）,但低于192 h。总体而言,本实验在青蛤肝胰腺组织内克隆得到的IL-17-3和IFITM1基因都参与了青蛤在氨氮胁迫环境下的免疫响应,说明长时间的氨氮胁迫对青蛤肝胰腺组织细胞中的免疫相关的IL-17-3和IFITM1基因起到了调控作用,氨浓度的积累可能引起青蛤的细胞损伤,使两个抗病基因发生非特异性免疫表达对青蛤的毒性机制提供了依据,也为进一步探究青蛤非特异性免疫的内容提供了参考。该论文有图29幅,表6个,参考文献167篇。