背景与目的：四肢手术如全膝关节置换术等使用止血带等可引起骨骼肌缺血再灌注损伤并通过炎症反应氧化应激等途径引起远隔重要器官甚至全身多器官损伤，其中以心血管系统的损伤最为重要。我们前期对骨骼肌缺血再灌注心肌损伤的机制进行了初步研究，发现炎细胞在心肌组织的聚集活化、全身及心肌局部炎性细胞因子的激活、过度的氧化应激及氧化－抗氧化体系的失衡、醛固酮的持续激活是骨骼肌缺血期及再灌注期心肌损伤的重要病理学基础，但其中的免疫调控机制还不是十分清楚。近来研究发现以高迁移率族蛋白B1（high-mobility groupbox protein1，HMGB1）及Toll样受体4（Toll-like receptor，TLR4）激活为特征的固有免疫系统激活在心、肺、肝、肾等脏器缺血再灌注损伤中具有重要作用。髄样分化初极反应基因88（Myeloid differentiation primary-response gene88，MyD88）是TLR4主要的衔接蛋白，TLR4和MyD88结合后可以激活下游的核因子-kB（NF-kB）信号通路，促发炎症反应。而HMGB1-TLR4-MyD88-NF-kB信号通路在骨骼肌缺血再灌注致远隔心肌损伤中的作用还不清楚，也未见研究报道。本研究通过：一、观察全膝关节置换术后患者单核细胞和中性粒细胞TLR4表达及血浆炎性细胞因子IL-6的变化，以及手术后细胞免疫、体液免疫及心肌损伤指标TnI的变化，明确全膝关节置换术致心肌损伤的作用及术后免疫功能的改变。二、观察HMGB1-TLR4-MyD88-NF-kB信号通路以及炎性细胞因子IL-6、IL-10、IL-17HMGB1在大鼠骨骼肌缺血再灌注心肌细胞损伤中的作用，及H2S和螺内酯（Spiron）对该信号通路及炎性细胞因子的调控作用，进一步深入研究骨骼肌缺血再灌注后心肌损伤的心肌局部免疫调控变化，并寻求有效的干预途径。同时观察HMGB1-TLR4-MyD88-NF-kB信号通路以及炎性细胞因子IL-6、IL-10、IL-17在大鼠骨骼肌缺血再灌注合并骨折及软组织创伤后心肌损伤中的作用，对严重的肢体复合伤造成心肌损伤的免疫机理进行初步探讨。方法：第一部分：双膝关节置换（术中须用止血带）手术病人15例，观察时间点：术前、术后4h、术后12h，采用自身对照研究。观察患者手术前后血浆肌钙蛋白-I（TnI）及IL-6、IgG、IgM、IgA水平的变化，利用流式细胞学技术观察患者手术前后淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+及单核细胞和中性粒细胞TLR4表达的变化。第二部分：雄性Wistar大鼠46只，应用止血带结扎构建大鼠双下肢缺血再灌注模型，随机分为6组，除IR+创伤组有6只大鼠外，其余各组均有8只大鼠：(1) C组：正常对照组。(2)IR组：缺血4小时再灌注4小时组。（3）IR+创伤组：大鼠双下肢结扎后，制造骨骼肌缺血再灌注加右股骨骨折及软组织损伤的复合创伤模型。骨骼肌缺血时间和再灌注时间同IR组。（4）IR+NaHS组：结扎前及再灌注前腹腔注射H2S供体硫氢化钠（NaHS）0.78mg/kg。（5）IR+PPG组：结扎前及再灌注前腹腔注射CSE酶抑制剂炔丙基甘氨酸（DL-propargylglycine，PPG）60mg/kg。（6）IR+Spiron组：结扎前每天给予Spiron (20mg/kg)灌胃持续6天。观察各组大鼠心肌细胞凋亡的改变及血浆心肌酶TnI的变化，观察大鼠血浆及心肌IL-6、IL-10、IL-17、HMGB1水平的变化，以Western Blot方法检测大鼠心肌HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κBp65、P-NF-κBp65蛋白含量，以Real time PCR方法检测大鼠心肌HMGB1、TLR4、MyD88mRNA表达，以免疫组化法观察大鼠心肌TLR4、P-NF-κBp65的表达。结果：第一部分：全膝关节置换术后4小时血浆单核细胞及中性粒细胞表面TLR4表达、IL-6、TnI水平较术前明显上升(P<0.05)，炎性细胞因子IL-6水平术后12小时较术后4小时继续显著上升(P<0.05)，血浆单核细胞及中性粒细胞表面TLR4表达及TnI水平术后12小时持续处于高水平，较术后4小时没有继续上升（P>0.05）。全膝关节置换术后12小时T淋巴细胞亚群CD4+的数量及CD4+/CD8+细胞比值明显下降(P<0.05)。全膝关节置换术后IgG、IgM、IgA水平没有明显变化（P>0.05）。第二部分：与正常对照组比较，骨骼肌缺血再灌注组大鼠血浆TnI水平及心肌凋亡指数明显升高，血浆及心肌IL-6、IL-10、IL-17、HMGB1水平显著上升，心肌HMGB1、TLR4、MyD88、P-NF-κBp65蛋白含量明显上升，心肌HMGB1、TLR4、MyD88mRNA表达显著上调（all P<0.05）。与骨骼肌缺血再灌注组比较，H2S和螺内酯干预可以明显降低血浆TnI水平及心肌凋亡指数，降低血浆及心肌IL-6、IL-17、HMGB1水平，升高血浆及心肌IL-10水平，使心肌HMGB1、TLR4、MyD88、P-NF-κBp65蛋白含量明显下降，心肌HMGB1、TLR4、MyD88mRNA表达显著下调（all P<0.05）；PPG干预和缺血再灌注合并创伤可以使血浆TnI水平及心肌凋亡指数继续升高，血浆及心肌IL-6、IL-17、HMGB1水平进一步升高，使心肌HMGB1、TLR4、MyD88、P-NF-κBp65蛋白含量明显上升，心肌HMGB1、TLR4、MyD88mRNA表达显著上调（all P<0.05），对血浆及心肌IL-10水平没有显著影响（P>0.05）。各组大鼠NF-κBp65蛋白表达没有显著差异（P>0.05）。免疫组化提示缺血再灌注组大鼠心肌细胞可见较多TLR4、P-NF-κBp65抗体阳性棕色染色颗粒，H2S和螺内酯干预组心肌细胞棕色染色颗粒明显减少，PPG干预和缺血再灌注合并骨创伤组棕色阳性染色颗粒进一步增多。结论：1，全膝关节置换术可造成心肌损伤，并激活机体的固有免疫及炎症反应，同时抑制细胞免疫功能。2、大鼠骨骼肌缺血再灌注可以上调全身和心肌局部的内源性危险分子HMGB1，激活心肌的固有免疫TLR4-MyD88-NF-κB信号通路，使血浆及心肌局部的前炎症细胞因子IL-6、IL-17及抗炎因子IL-10大量释放，从而加重心肌细胞凋亡和损伤。3、硫化氢供体NaHS以及醛固酮特异性拮抗剂螺内酯均可以通过降低大鼠骨骼肌缺血再灌注后全身和心肌局部的内源性危险分子HMGB1的水平，抑制心肌的固有免疫TLR4-MyD88-NF-κB信号通路激活，下调血浆及心肌的前炎症细胞因子IL-6、IL-17水平，增加血浆和心肌的抗炎细胞因子IL-10的水平，从而减轻骨骼肌缺血再灌注后心肌的炎症反应及心肌细胞凋亡和损伤。证明醛固酮与受体结合和H2S体系抑制可激活机体的固有免疫HMGB1-TLR4-MyD88--NF-κB信号通路介导炎症反应，导致骨骼肌缺血再灌注心肌损伤。4、大鼠骨骼肌缺血再灌注合并骨创伤可以进一步增加全身和心肌局部的内源性危险分子HMGB1释放，激活心肌的固有免疫TLR4-MyD88-NF-κB信号通路，从而加重炎症反应，加重心肌细胞凋亡和损伤。