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目的:烟草烟雾(Cigarette smoke,CS)中含有上千种如尼古丁、焦油、CO等有害物质,能够损伤人体多个系统。近年来,女性主动吸烟和被动吸烟的人数在全世界范围内增加,育龄期妇女吸烟率呈明显上升趋势,然而很多育龄期的女性尚未意识到吸烟对女性生育功能所造成的损伤。研究发现,吸烟可导致女性子宫发育受损,例如影响子宫内膜蜕膜化过程,使子宫内膜不规则成熟和受精卵着床率降低等。本研究主要探索了CS暴露导致子宫损伤的机制,以及临床上能够治疗吸烟引起女性子宫损伤的靶标。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)已经作为多种疾病的治疗靶标而受到广泛关注。本课题组之前的研究结果也表明CS暴露能够通过激活HDAC1/2导致子宫组织形态学改变,而HDAC的抑制剂曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)能够重新激活自噬缓解CS暴露诱导的子宫组织形态学改变。CS中含有多种有害物质,因此TSA能否通过其它途径缓解CS暴露导致的子宫损伤需要进一步探索。重组嘌呤能受体P2RX7(Recombinant Purinergic Receptor P2X,Ligand Gated Ion Channel 7,P2RX7)主要存在于免疫细胞中,它的过表达与许多生理/病理生理过程有关。研究发现P2RX7可介导炎症反应和细胞凋亡的发生,而P2RX7受体介导的炎症反应和细胞凋亡是否参与了CS暴露导致的子宫损伤?P2RX7受体介导的炎症反应和细胞凋亡是否参与TSA对CS暴露导致的子宫组织损伤的缓解作用?A438079(P2RX7抑制剂)是否能够缓解CS暴露诱导的小鼠子宫组织损伤?目前,尚需要进一步探索。研究方法:(1)实验分组和标本采集:SPF级健康C57BL/6雌性小鼠,将60只C57BL/6小鼠分成5组,即对照组、CS暴露组、CS暴露+TSA组、CS暴露+BzATP(P2RX7激动剂)组、CS暴露+A438079(P2RX7抑制剂)组。CS暴露期间记录各组小鼠体重变化,在CS暴露30 d后,每组中至少取5只小鼠的子宫组织,称重发情阶段的子宫组织湿重,固定或-80℃冷冻保存。(2)CS暴露后小鼠子宫组织结构变化:HE染色在显微镜下观察CS暴露后小鼠子宫组织结构变化。(3)CS暴露后小鼠子宫组织中炎症反应和细胞凋亡相关蛋白的表达水平:使用Western blot技术检测CS暴露后小鼠子宫组织中P2RX7、NLRP3炎性小体相关因子(ASC、NLRP3、IL-1β和cleaved caspase1)和细胞凋亡相关蛋白(BCL-2、cleaved caspase3和cleaved caspase9)的表达水平。(4)TSA治疗后小鼠子宫组织中炎症反应和细胞凋亡相关蛋白的表达水平:使用Western blot技术检测TSA治疗后CS暴露小鼠子宫组织中P2RX7、NLRP3炎性小体相关因子和细胞凋亡相关蛋白的表达水平。(5)TSA治疗后NLRP3炎性小体相关因子的mRNA水平:实时荧光定量(Real time-PCR)法检测TSA治疗后CS暴露小鼠子宫组织中Hdac1、P2rx7、Asc和Il-1β的mRNA转录水平。(6)A438079治疗后CS暴露小鼠子宫组织结构变化:使用HE染色方法在显微镜下观察A438079治疗后CS暴露小鼠子宫组织的结构变化。(7)A438079治疗后CS暴露小鼠子宫组织炎症反应相关蛋白的表达水平:使用Western blot技术检测小鼠子宫组织中P2RX7和NLRP3炎性小体相关因子的表达水平;免疫组织化学方法检测CS暴露小鼠子宫组织中炎性细胞ASC和IL-1β的表达水平;免疫荧光双染观察A438079治疗后CS暴露小鼠子宫组织的炎性细胞浸润情况。(8)A438079治疗后CS暴露小鼠子宫组织中细胞凋亡相关蛋白的表达水平:使用Western blot技术检测A438079治疗后CS暴露小鼠子宫组织中细胞凋亡相关蛋白的表达水平。结果:(1)CS暴露导致小鼠子宫组织形态学改变:CS暴露后小鼠子宫组织肌层明显变薄、间质细胞和腺体数量明显减少。(2)CS暴露导致小鼠子宫组织发生炎症反应和细胞凋亡:CS暴露诱导小鼠子宫组织中P2RX7、NLRP3炎性小体相关因子(NLRP3、ASC、IL-1β和cleaved caspase1)和细胞凋亡相关蛋白(BCL-2、cleaved caspase3和cleaved caspase9)的表达水平明显上调。(3)TSA缓解了CS暴露诱导的小鼠子宫组织炎症反应和细胞凋亡的发生:TSA抑制了CS暴露诱导的小鼠子宫组织P2RX7、NLRP3炎性小体相关因子和细胞凋亡相关蛋白的表达水平上调。(4)TSA缓解了CS暴露诱导的小鼠子宫组织NLRP3炎性小体相关因子的mRNA转录活性升高:TSA明显抑制了CS暴露诱导的小鼠子宫组织Hdac1、P2rx7、Asc和Il-1β的mRNA转录水平升高。(5)A438079改善了CS暴露导致的小鼠子宫组织形态学变化:A438079缓解了CS暴露导致的小鼠体重下降和子宫组织湿重降低。HE染色结果显示A438079明显改善了CS暴露导致的小鼠子宫肌层变薄、间质细胞和腺体数量减少。(6)A438079抑制了CS暴露诱导的子宫组织炎症反应的发生:Western blot结果显示A438079明显抑制了CS暴露诱导的小鼠子宫组织P2RX7和NLRP3炎性小体相关蛋白的表达水平上调;免疫组织化学结果显示A438079抑制了CS暴露导致的炎性细胞IL-1β和ASC的活化;免疫荧光双染结果显示A438079抑制了CS暴露导致的子宫组织炎性细胞浸润增强。(7)A438079抑制了CS暴露诱导的子宫组织细胞凋亡的发生:A438079明显抑制了CS暴露诱导的子宫组织细胞凋亡相关蛋白(BCL-2、cleaved caspase3和cleaved caspase9)的表达升高。结论:1、CS暴露导致小鼠子宫组织形态学改变。2、P2RX7介导的炎症反应和细胞凋亡参与了TSA缓解的CS暴露所致的小鼠子宫损伤过程。3、A438079通过抑制P2RX7介导的炎症反应和细胞凋亡缓解了CS暴露导致的子宫组织形态学改变。