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A型流感病毒属于正粘病毒科,病毒基因组共有8个片段,至少编码11种蛋白。病毒粒子表面囊膜上有血凝素(hemagglut inin, HA)与神经氨酸酶(neuraminidase, NA)两种表面纤突。根据HA与NA的不同可区分为不同的亚型,H有H1-H16,而N有N1～N10。禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)血清亚型众多,抗原变异性强,宿主范围广泛,亚型之间无交叉保护性。在禽流感的HA亚型中,只有H5和H7亚型对禽是高致病性的,称为高致病性禽流感(High pathogenic avian influenza, HPAI)。近年在全球时见报道的主要是H5N1和H7N1亚型以及去年报道的H7N9亚型AIV。比如1997年香港H5N1亚型AIV直接感染人并致死；1999-2000年在意大利爆发的H7N1病毒导致1300多万羽鸡死亡,造成重大经济损失；2003年荷兰爆发了H7N7亚型禽流感,不仅导致了重大的经济损失,而且感染89人。去年爆发的H7N9亚型AIV,造成超过300余人感染,50多人死亡。这些事件提示高致病性禽流感不仅会给养禽业造成巨大经济损失,同时还可以跨越宿主屏障直接感染人,严重威胁公共卫生安全。因此,AIV的早期快速诊断和及时监测,对保障全球养禽业的发展和人类健康至关重要。目前,灵敏、特异的分子生物学检测技术,如荧光定量RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)等方法已经在禽流感的病毒检测中发挥着重要作用,但这些方法都需要复杂的仪器设备(如PCR仪、荧光显微镜等)和具有一定操作技能的实验室人员,在一些基层的实验室使用时受到限制。如何能够针对最先接触疫情的基层实验室,不需要昂贵的仪器就能在现地养殖场进行快速、准确的检测,是迫切需要解决的实际问题。恒温条件下即能进行反应的环介导恒等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测技术应运而生。与传统的PCR和荧光定量PCR相比,LAMP不需要昂贵的仪器设备,具有简便、快速、灵敏、特异的特点,尤其适合在基层和现地开展病原微生物的早期诊断和筛查。本研究的目的是通过设计针对特异识别AIV的M、HA、NA基因序列中6个不同区段的LAMP引物,建立一系列能够快速便捷地检测A型禽流感病毒的有效方法。主要包括以下研究内容：1、A型通用型AIV RT-LAMP检测方法的建立根据GenBank中登录的A型禽流感病毒(AIV)(A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1))的基质蛋白M基因序列,设计了一套特异识别M基因序列中6个不同区段的环介导恒等温扩增(LAMP)引物,并以此套引物建立了一种基于RT-LAMP技术的A型禽流感病毒诊断方法。结果显示,该方法能检测不同亚型的AIVs,且扩增反应可在30min内完成,对各型AIVs的最小检测限为0.01PFU的病毒含量,敏感性是常规RT-PCR方法的100倍。若在反应体系中添加Fluorescent Detection Reagent(核黄绿素)染料后,可通过肉眼观察有无特异的绿色荧光来直接判定结果。该方法仅需一个恒温水浴锅就可完成扩增反应,非常适合现地及临床AIV病原的诊断和疫情监测。2、H9亚型禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立根据H9亚型禽流感病毒(A/Chicken/HuNan/33/2008(H9N2))血凝素基因序列,设计了一套特异识别HA基因序列的LAMP引物,并以此套引物建立了检测H9亚型禽流感病毒的RT-LAMP诊断方法。结果显示,该方法能特异的检测H9亚型AIV,全部反应可在30min内完成,对H9亚型AIV的最小检测限为0.01PFU的病毒含量,灵敏度高于普通一步法RT-PCR100倍；对近年来分离到的6株H9N2亚型AIV的检测,该方法能对其进行良好的检测；通过对人工感染棉拭子样品的检测,发现RT-LAMP和病毒分离方法可从第1d即可检测到病毒,而常规RT-PCR方法到第3d才能检测到病毒,进一步证明H9亚型AIVRT-LAMP方法的敏感性好,利于H9亚型AIV的早期诊断。3、H5亚型禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立根据H5亚型禽流感病毒(A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1))血凝素基因序列,设计了一套特异识别H5亚型AIV HA基因的LAMP引物,并以此套引物建立了用于检测H5亚型禽流感病毒的RT-LAMP诊断方法。结果显示,方法能特异的检测H5亚型AIV,与其他亚型流感病毒及常见禽病病原无非特异性反应,该方法对H5亚型AIV的最小检测限为0.1PFU的病毒含量,灵敏度高于普通一步法RT-PCR10倍,全部反应可在30min内完成。通过对不同宿主来源的H5亚型AIV分离株的检测表明,该方法能够特异性地检测禽源、鸭源和猪源的H5亚型AIV。4、H7N9亚型禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立根据H7亚型禽流感病毒(A/Chicken/HeB/2/2002(H7N2))血凝素基因序列,设计了一套特异识别H7亚型AIV HA基因序列的LAMP引物,并以此套引物建立了检测H7亚型禽流感病毒的RT-LAMP诊断方法。结果显示,该方法能特异的检测H7亚型AIV,与其他亚型流感病毒无非特异性反应。通过对H7亚型AIV不同致病力毒株的检测表明,该方法对LPAIV的H7亚型AIV的最小检测限为0.01PFU的病毒含量；对HPAIV的H7亚型AIV的最小检测限为0.1PFU的病毒含量；对不同来源的H7N9病毒的最低检测限为0.01PFU的病毒含量。这些结果表明,该方法可特异性地检测低致病性和高致病性H7亚型AIV以及新出现的H7N9流感病毒。此外,通过人工感染实验样品检测表明,RT-LAMP方法和病毒分离都能够在病毒感染后第1d检测到排毒,而一步法RT-PCR需要在感染后3d才能检测到排毒,进一步证明该方法的灵敏度高。针对H7N9流感病毒(A/chicken/Shanghai/S1053/2013(H7N9))NA基因序列,设计了1套特异识别NA基因序列的RT-LAMP引物,并以此套引物建立了检测N9亚型AIV的RT-LAMP诊断方法。该方法的最小检测限为0.01PFU的病毒含量,灵敏度高于普通一步法RT-PCR100倍。从上海和安徽省的活禽市场、养殖场和野鸟栖息地采集了大量的临床样品(包括饮水、土壤、泄殖腔拭子、喉拭子样品),检测结果表明,H7N9RT-LAMP方法可在30min内完成样品检测,而且能够有效的从不同来源样品中检测到H7N9流感病毒,进一步证明该方法的可靠性和实用性。LAMP方法不需要昂贵的特殊仪器设备,反应结果可用肉眼直接观察,非常适合在基层开展病原微生物的早期诊断和筛查。本研究建立的AIV系列RT-LAMP方法具有特异性好、灵敏度高、简便快速、实用的优点,不仅为禽流感病毒的诊断、监测、早期预警提供了技术保障,而且也为禽流感的有效防控提供技术支撑。