CRISPR/Cas系统作为目前应用最为广泛的基因编辑技术之一,可以通过单链导向RNA（single-guide RNA,sgRNA）的引导在基因组中特定的位点产生双链断裂,随后借助宿主细胞的非同源末端连接（Non-homology end joining,NHEJ）与同源重组（Homology-directed repair,HDR）两种主要的修复方式来实现基因组编辑。尽管NHEJ发生的效率较高,但是其往往会导致断裂位点产生随机的碱基插入和缺失,无法实现精确的编辑。相比之下,HDR可以在人为提供供体模板的情况下实现包括基因插入、碱基替换等在内的几乎所有形式的精确编辑。因而在实际应用中,HDR具有极大的应用前景,但是其发生的概率远低于NHEJ,极大的限制了其发展。为解决上述问题,本研究通过两个方面来改进同源重组体系。首先,将生物素修饰引入到双链供体两端,同时将链霉亲和素单体与Cas9蛋白融合表达,借助生物素-链霉亲和素之间的强相互作用来将Cas9蛋白与供体模板聚集在一起,这样Cas9蛋白切割目标DNA后,附近的供体模板可以更加容易参与到同源重组修复过程中去,以此来提高同源重组的效率。结果表明,该方法可以在猪PK-15细胞系和人K562细胞系两种不同物种的细胞中将HDR效率提高至10%左右,相比没有融合链霉亲和素的普通Cas9蛋白效率提高了约一倍。另外,在鉴定的约40个阳性单细胞克隆中,约有8%的克隆表现为双等位基因编辑。其次,本研究还从改进同源重组的筛选方法上入手,希望尽可能的富集那些发生同源重组的阳性细胞。本实验采用了基于NHEJ的荧光报告系统,该系统可以用来指示Cas9等核酸酶的切割活性,只有当核酸酶成功发挥切割作用后通过宿主细胞的NHEJ修复方式产生移码突变后才会出现荧光,而且该系统独立于基因组外发挥功能,可以较大程度降低筛选基因对宿主细胞的影响。我们构建了能够将EcoRⅠ酶切位点整合到人的AAVS1、DNMT2、EMX1基因的不同位点的同源供体模板,随后与NHEJ荧光报告质粒共同转染到HEK293T和K562细胞中,通过富集那些NHEJ荧光报告质粒发挥作用的细胞,并对编辑位点PCR产物进行EcoRⅠ酶切检测,结果显示该报告系统可以间接富集到发生同源重组的细胞,并且适用于hCas9、esp Cas9、Cpf1等不同的CRISPR/Cas系统。最后,本研究尝试结合上述两种方法,将生物素修饰供体、融合有链霉亲和素的Cas9蛋白与改造后的NHEJ荧光报告质粒共同转染K562细胞,结果发现利用NHEJ荧光报告质粒富集到的细胞中发生同源重组的细胞可以占到30%以上。鉴于此时的NHEJ荧光报告质粒仅能够指示Cas9与sgRNA的切割活性,无法指示同源供体模板的存在。因此我们又对该体系进行了优化:将sgRNA融合到生物素修饰供体上,此时,NHEJ荧光报告质粒一旦出现荧光,就表明该细胞中含有同源重组发生所需的Cas9、sgRNA与同源供体模板三个元件。初步的流式分析结果显示,优化后的体系能够进一步将被富集细胞中同源重组的效率提高至50%-80%。综上所述,我们分别从提高同源重组效率和改进阳性细胞富集筛选方法两个方面入手,最终建立了一种更加高效的同源重组方法。该方法的建立可以作为基于HDR的精确编辑的补充部分,在动植物育种、基因治疗与基因功能研究方面提供一定的促进作用。