2008年,肝癌发病人数已达到74.83万人,死亡人数超过69.59万人。我国肝癌发病人数和死亡人数均超过全球的一半。肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是肝癌中最主要的病理类型,晚期HCC病人的自然生存时间只有三个月左右。即使经过根治性切除,HCC术后的高转移复发率也成病人迈向健康之路的一道沟壑。而今针对晚期HCC病人的治疗手段缺乏,其中最有效的靶向治疗药物价格昂贵,而且并不是所有病人都可以受益。因此,有效的对HCC病人转移复发的预测指标,既可以指导对HCC病人进一步细分类型,而且可以指导制定提前干预措施。最适合作为预后诊断指标的样本应来源于对病人创伤最小的方法,许多血液中的肿瘤指标都是糖蛋白给了我们启示,如肝癌中的甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein, AFP)。在病人血清糖蛋白中筛选与HCC预后相关的指标提上日程。糖蛋白中N-糖基化(N-linked glycosylation)占绝对优势,人外周循环中除白蛋白、C反应蛋白外,绝大部分蛋白都是N-糖基化蛋白。N-糖基化是新合成蛋白进行糖基化修饰的一种方式。糖通过与蛋白质的天冬酰胺的自由NH2基连接,此过程在内质网中进行。王骥博士应用凝集素(Lectin)层析纯化得到病人术前血清中的N-糖蛋白,进行定量糖蛋白质组学研究,得到的结果显示,血清中LCH (Lens culinaris hemagglutinin,小扁豆血凝素)富集的QSOX1 (Sulfhydryl oxidase 1,氢硫基氧化酶1)糖蛋白(即带有α-1,6岩藻糖基化的QSOX1蛋白),其表达水平在未复发组显著高于复发组。QSOX1氨基酸序列的130、243、575三个位置存在潜在的N-糖基化位点,王骥博士只在130这一位置发现N-糖基化,与以往报道一致。这些为我们研究QSOX1在HCC中的分布规律和生物学作用提供了有力支持。QSOX1蛋白在诸多肿瘤中均已有报道,而对其利害作用的表述莫衷一是,这与QSOX1的分布多样和作用广泛不无关系。本课题基于课题组前期结果,针对a-1,6岩藻糖基化的QSOX1这一差异指标建立研究方法和干预模型,对QSOX1蛋白的短链形式QSOX1-S (QSOX1 short)在肝癌细胞中的作用机制及在病人预后中扮演的角色深入研究。在研究N-糖链的作用时,我们构建了去N-糖基化的突变蛋白过表达细胞系,与野生型的QSOX1-S过表达细胞株进行对比,探索N-糖链对QSOX1-S蛋白发挥作用的必要性,为构建干预蛋白表达体系做出指导。第一部分QSOX1蛋白在肝癌细胞和组织中的表达及与肝癌病人预后的关系目的：拥有两种形式的QSOXl蛋白被发现在越来越多的肿瘤中发挥重要作用,但报道不尽相同,而两种蛋白形式是否具有相似的作用,说法不一。我们将针对QSOX1蛋白在肝癌中的表达及其对病人预后的影响进行研究。方法：应用Western blot在不同的人肝癌细胞系、肝细胞系及星状细胞系中检测QSOX1的总蛋白表达,研究其野生状态下的表达规律。免疫组织化学染色法探索QSOX1在肝癌组织的表达及定位。并使用LCH凝集素富集组织中的f-QSOX1蛋白,研究其在组织中的分布。在Kaplan-Meier曲线中应用Log-rank分析QSOX1的蛋白表达同病人预后的相关性,同时应用Cox回归模型检验其作为预后预测因子的独立性。结果：QSOX1的两种蛋白形式在Western blot中分布于不同条带, QSOX1-S,即短链分泌形式蛋白(67Kd)的表达随肝癌细胞系转移潜能的降低而明显升高,而星状细胞系中表达只处于低水平。组织芯片的免疫组化结果显示,QSOX1蛋白在癌组织中的表达显著高于癌旁组织。结合临床资料统计显示,QSOX1在癌组织高表达代表良好的预后,而在癌旁组织中的高表达则代表不良预后。明确了QSOX1在癌组织的弥漫阳性表达类型即代表QSOX1-S的高表达。癌组织的QSOX1-S表达与复发有更高的相关性,Cox回归模型结果也提示,QSOX1-S为生存和复发的独立预后因素。癌组织f-QSOX1占QSOX1-S的比例显著高于癌旁。联合癌与癌旁组织QSOX1-S的表达情况可以有力预测病人预后,将大大提升预测效能。结论：QSOX1-S蛋白表达与肝癌细胞的转移潜能呈负相关。QSOX1在癌组织高表达代表良好的预后,而在癌旁组织中的高表达则代表不良预后。癌组织的QSOX1-S表达与复发有更高的相关性。QSOX1在癌组织与癌旁组织中出现的趋势分离是由于f-QSOX1占QSOX1-S的比例不同导致,这使血清学与组织学达到统一。联合癌与癌旁组织QSOX1-S的表达情况可以有力预测病人预后。第二部分QSOX1-S蛋白对肝癌细胞株生物学行为的影响及机制研究目的：本研究应用慢病毒载体构建QSOX1-S的干扰和过表达稳转细胞株,探讨QSOX1-S对肝癌细胞在体内外生物学功能的影响。同时研究QSOX1-S对肿瘤相关信号通路的影响。方法：利用慢病毒载体,在QSOX1-S高表达的Hep3B肝癌细胞株中构建干扰QSOX1-S的稳转细胞株,在低表达的MHCC97-H (97H)中构建了过表达QSOX1-S的稳转细胞株,Western blot验证稳转的效率。CCK8检测细胞增殖增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期,Transwell、室侵袭实验检测细胞侵袭能力。建立裸鼠肝原位移植瘤模型研究QSOX1-S对肝癌细胞在体内的增殖、侵袭功能的影响。Western blot检测QSOX1-S对肿瘤相关的信号通路的影响。结果：Western blot验证显示,干扰QSOX1-S的稳转细胞株在Hep3B中建立成功,过表达QSOX1-S的稳转细胞株在MHCC97-H中建立成功。QSOX1-S的干扰细胞株Hep3B-shQSOX1的增殖能力、抗凋亡能力、侵袭能力显著强于其对照组,过表达细胞株97H-QSOX1-S的抗凋亡能力、侵袭能力显著弱于对照组细胞。在裸鼠肝原位移植瘤模型中,干扰QSOX1-S显著增加了移植瘤的体积,同时增加了肺转移率：而过表达QSOX1-S的对移植瘤的体积改变并不明显,但却大大降低了97H的肺转移率。肿瘤学相关的信号通路中,QSOX1-S蛋白显著抑制EGFR (RTK/Ras/MAPK)及Integrinβ1/FAK/ERK通路。结论：QSOX1-S蛋白上调对肝癌细胞的侵袭转移有遏制作用,并且通过作用于EGFR及Integrin β 1两条信号转导通路来发挥上述遏制效应。第三部分N-糖基化修饰对QSOX1-S蛋白功能的影响目的：构建去除130位N-糖链的蛋白QSOXl-SM的过表达细胞株,与野生型QSOX1-S过表达株比较,研究N-糖链对QSOX1-S蛋白功能的影响。探讨合成干预用重组QSOX1-S蛋白的可能性。方法：利用点突变使过表达质粒表达出的QSOX1-S蛋白失去130位氨基酸的N-糖链。将以上质粒转入97H细胞中,构建稳定过表达突变蛋白QSOXl-SM或QSOX1-SM2的细胞株。CCK8检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡和周期,Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力。裸鼠皮下移植瘤模型研究体内成瘤及肺转移能力的改变。Western blot检测肿瘤相关通路的变化。结果：在体外细胞功能实验中,97H-QSOX1-SM与其对照组相比,在细胞增殖、细胞凋亡比例和周期、细胞侵袭能力都无显著改变,另外在裸鼠体内实验中,97H-QSOX1-SM与对照组相比,皮下移植瘤体积和肺转移率也无显著差异。肿瘤相关信号通路EGFR和Integrinβ1也无显著改变。在另一突变蛋白过表达细胞株97H-QSOX1-SM2中,细胞的增殖能力、抗凋亡能力、侵袭能力均强于对照组细胞,肿瘤相关信号通路EGFR、Integrinβ1较对照组细胞有所上调,Wnt通路显著上调。结论：改变肝癌细胞QSOX1-S中f-QSOX1的比例,会导致细胞生物学行为的逆转。130位N-糖链对QSOX1-S蛋白发挥肿瘤抑制生物学功能至关重要。合成干预用的重组蛋白需考虑真核表达系统(N-糖基化修饰不可或缺)。结论1. QSOX1在癌组织与癌旁组织中出现的趋势分离是由于f-QSOX1占QSOX1-S的比例不同导致,这使血清学与组织学达到统一。联合癌与癌旁组织QSOX1-S的表达情况可以有力预测病人预后。2. QSOX1-S上调对肝癌细胞的侵袭转移有遏制作用,QSOX1-S蛋白通过作用于EGFR及Integrinβ1两条信号转导通路来发挥上述这种遏制作用的。3.改变肝癌细胞QSOX1-S中f-QSOX1的比例,会导致细胞生物学行为的逆转。130位N-糖链对QSOX1-S蛋白发挥肿瘤抑制生物学功能至关重要。4.合成干预用的重组蛋白需考虑真核表达系统(N-糖基化修饰不可或缺)。创新点1.首次报道了QSOX1-S蛋白在HCC中的分布规律及作用机制。2.首次报道了QSOX1-S蛋白通过EGFR及Integrinβ1通路抑制HCC细胞的恶性表型。3.发现肝癌细胞QSOX1-S中f-QSOX1的比例改变会导致细胞生物学行为的逆转。4.首次报道了QSOX1-S蛋白的130位N-糖基化修饰对其行使生物学功能至关重要,为有效干预蛋白的合成提供了有力的理论依据。潜在应用价值1. QSOX1-S蛋白可用于病理诊断,判断HCC病人的预后。2. QSOX1-S蛋白可作为靶向药物的替代或联合用药。