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由玉米狄克氏菌(Dickeya zeae)引致的水稻基腐病是世界分布的水稻重要病害,对水稻高产、稳产具有极大的潜在威胁。对水稻基腐病菌致病调控机理及病原菌与水稻间的相互关系的研究,可为该病原菌致病调控网络的构建提供依据,同时,也为病害防控提供新靶标。
多胺是生物体中广泛存在的具有生物活性的脂肪族含氮碱,是一类重要的通讯信号分子,具有重要的生物功能。本论文深入研究了水稻基腐病菌多胺合成和转运相关基因的功能,主要结果如下:
根据已知的大肠杆菌(Escherichia coli)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)多胺生物合成途径相关酶基因speA、speC、speE、aguA和aguB的蛋白序列和大肠杆菌腐胺转运蛋白基因potF和plaP的蛋白序列,分别在水稻基腐病菌EC1菌株基因组数据库中BLAST到同源基因。对7个同源基因分别进行基因敲除和功能互补,筛选出3个泳动运动性显著降低的突变体ΔA、ΔAguA和ΔAguB。对基因speA敲除突变体ΔA进行了生物化学分析和致病性测定,结果表明,该基因敲除细胞运动性显著降低,生物膜产量下降,互补体或外源添加腐胺可以恢复到野生菌株水平;细胞内腐胺浓度显著降低;突变体ΔA对水稻种子侵染能力和萌发抑制率降低。因而,SpeA为水稻基腐病菌腐胺生物合成所必需。
在基因speA敲除突变体ΔA遗传背景下对腐胺转运蛋白基因potF和plaP分别进行单敲除并进行功能互补,获得双敲除突变体ΔA-potF、ΔA-plaP和互补体ΔA-potF(potF),并进行表型分析。结果表明,与突变体ΔA相比,敲除突变体ΔA-potF运动性显著降低,而ΔA-plaP运动性没有发生改变。同时,对基因potF和plaP进行双敲除并进行功能互补,获得三敲除突变体ΔA-potF-plaP(Δ3A)和互补体Δ3A(potF)、Δ3A(plaP)。结果发现,与ΔA相比Δ3A运动性显著降低,且外源添加腐胺能使互补体Δ3A(potF)和Δ3A(plaP)运动性恢复但不能将突变体Δ3A运动性恢复,表明potF和plaP是腐胺转运蛋白基因。另外,腐胺转运蛋白potF和plaP功能突变体Δ3A不能转运并利用野生菌株EC1和水稻组织浸提物中的腐胺信号分子恢复运动性,而突变体ΔA能转运并利用野生菌株EC1和水稻组织浸提物中腐胺恢复其运动性,表明腐胺是D.zeaeEC1细胞与细胞间、D.zeaeEC1与寄主植物水稻间交流的重要化学通讯信号。
通过实时荧光定量PCR分析腐胺对其受体蛋白基因potF和plaP表达的影响,结果表明,在swimming培养液中2个基因在敲除突变体ΔA中的表达量显著升高,分别增加了13倍和9倍,同时,外源添加腐胺能将敲除突变体中基因potF和plaP的表达水平恢复到野生型水平。RT-PCR检测结果与实时荧光定量PCR分析结果一致。另外,分别将基因plaP和potF启动子区与载体pPROBE融合构建并获得两个基因报告菌株EC1(pplaPgfp)、?A(pplaPgfp)、EC1(ppotFgfp)和?A(ppotFgfp);通过流式细胞仪测定4个报告菌株中基因potF和plaP的表达水平,结果表明,基因plaP和potF在突变体ΔA中表达量显著升高,且外源添加腐胺使2个基因表达量恢复到野生型水平。因而认为,在swimming培养基中腐胺抑制其受体蛋白基因plaP和potF的表达。
通过抑菌圈法对突变体ΔA、ΔA-potF和Δ3A毒素产量进行测定,结果表明,突变体毒素产量与野生型没有明显差异。另外,与野生菌株EC1相比,突变体ΔA对水稻种子侵染能力和种子萌发抑制率都降低;同时,与敲除突变体ΔA相比,双敲除突变体ΔA-potF和三敲除突变体Δ3A对水稻种子萌发抑制作用显著降低,且突变体Δ3A对水稻种子侵染能力显著降低。
总之,本研究发现精氨酸脱羧酶SpeA是腐胺合成关键酶,腐胺是水稻基腐病菌细胞与细胞间,病原菌与寄主植物间交流的重要通讯信号,调控病原菌的细胞运动性和生物膜产生,及腐胺转运蛋白基因的表达,同时,影响病原菌致病性。对腐胺信号途径和调控机制的深入研究将有助于发现新的防控途径。
多胺是生物体中广泛存在的具有生物活性的脂肪族含氮碱,是一类重要的通讯信号分子,具有重要的生物功能。本论文深入研究了水稻基腐病菌多胺合成和转运相关基因的功能,主要结果如下:
根据已知的大肠杆菌(Escherichia coli)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)多胺生物合成途径相关酶基因speA、speC、speE、aguA和aguB的蛋白序列和大肠杆菌腐胺转运蛋白基因potF和plaP的蛋白序列,分别在水稻基腐病菌EC1菌株基因组数据库中BLAST到同源基因。对7个同源基因分别进行基因敲除和功能互补,筛选出3个泳动运动性显著降低的突变体ΔA、ΔAguA和ΔAguB。对基因speA敲除突变体ΔA进行了生物化学分析和致病性测定,结果表明,该基因敲除细胞运动性显著降低,生物膜产量下降,互补体或外源添加腐胺可以恢复到野生菌株水平;细胞内腐胺浓度显著降低;突变体ΔA对水稻种子侵染能力和萌发抑制率降低。因而,SpeA为水稻基腐病菌腐胺生物合成所必需。
在基因speA敲除突变体ΔA遗传背景下对腐胺转运蛋白基因potF和plaP分别进行单敲除并进行功能互补,获得双敲除突变体ΔA-potF、ΔA-plaP和互补体ΔA-potF(potF),并进行表型分析。结果表明,与突变体ΔA相比,敲除突变体ΔA-potF运动性显著降低,而ΔA-plaP运动性没有发生改变。同时,对基因potF和plaP进行双敲除并进行功能互补,获得三敲除突变体ΔA-potF-plaP(Δ3A)和互补体Δ3A(potF)、Δ3A(plaP)。结果发现,与ΔA相比Δ3A运动性显著降低,且外源添加腐胺能使互补体Δ3A(potF)和Δ3A(plaP)运动性恢复但不能将突变体Δ3A运动性恢复,表明potF和plaP是腐胺转运蛋白基因。另外,腐胺转运蛋白potF和plaP功能突变体Δ3A不能转运并利用野生菌株EC1和水稻组织浸提物中的腐胺信号分子恢复运动性,而突变体ΔA能转运并利用野生菌株EC1和水稻组织浸提物中腐胺恢复其运动性,表明腐胺是D.zeaeEC1细胞与细胞间、D.zeaeEC1与寄主植物水稻间交流的重要化学通讯信号。
通过实时荧光定量PCR分析腐胺对其受体蛋白基因potF和plaP表达的影响,结果表明,在swimming培养液中2个基因在敲除突变体ΔA中的表达量显著升高,分别增加了13倍和9倍,同时,外源添加腐胺能将敲除突变体中基因potF和plaP的表达水平恢复到野生型水平。RT-PCR检测结果与实时荧光定量PCR分析结果一致。另外,分别将基因plaP和potF启动子区与载体pPROBE融合构建并获得两个基因报告菌株EC1(pplaPgfp)、?A(pplaPgfp)、EC1(ppotFgfp)和?A(ppotFgfp);通过流式细胞仪测定4个报告菌株中基因potF和plaP的表达水平,结果表明,基因plaP和potF在突变体ΔA中表达量显著升高,且外源添加腐胺使2个基因表达量恢复到野生型水平。因而认为,在swimming培养基中腐胺抑制其受体蛋白基因plaP和potF的表达。
通过抑菌圈法对突变体ΔA、ΔA-potF和Δ3A毒素产量进行测定,结果表明,突变体毒素产量与野生型没有明显差异。另外,与野生菌株EC1相比,突变体ΔA对水稻种子侵染能力和种子萌发抑制率都降低;同时,与敲除突变体ΔA相比,双敲除突变体ΔA-potF和三敲除突变体Δ3A对水稻种子萌发抑制作用显著降低,且突变体Δ3A对水稻种子侵染能力显著降低。
总之,本研究发现精氨酸脱羧酶SpeA是腐胺合成关键酶,腐胺是水稻基腐病菌细胞与细胞间,病原菌与寄主植物间交流的重要通讯信号,调控病原菌的细胞运动性和生物膜产生,及腐胺转运蛋白基因的表达,同时,影响病原菌致病性。对腐胺信号途径和调控机制的深入研究将有助于发现新的防控途径。