DNA复制叉(DNAreplication fork)是DNA复制的基本结构,它的完整性对基因组稳定性的维持至关重要,直接决定了细胞的命运。在机体内外各种复制压力的作用下,DNA复制叉极易受到干扰,产生损伤,导致DNA复制停滞。严重者可以影响基因组的稳定性,诱发细胞的癌变、凋亡、坏死等。DNA复制叉稳定性的维持是一个错综复杂的过程,需要多种DNA损伤修复蛋白的参与。X 线修复交错互补基因 1(X-ray repair cross complementing gene 1,XRCC1)是一个重要的DNA损伤修复基因。它的编码蛋白XRCC1主要由3个结构域组成,即氨基端的结构域(NTD,1-183氨基酸区域)、羧基端的乳腺癌易感基因羧基端2结构域(BRCT II)、中间的乳腺癌易感基因羧基端1结构域(BRCT I)。XRCC1可以借助其结构域与DNA聚合酶β、DNA连接酶3α等多种DNA损伤修复蛋白结合。XRCC1主要参与DNA的单链损伤修复(Single strand break repair,SSBR)和碱基切除修复(Base excision repair,BER)。已有研究表明,XRCC1可以在DNA复制叉处聚集。但XRCC1对DNA复制叉停滞的重新启动方面的研究,目前尚未见报道。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)是存在于多数真核细胞中的一个多功能蛋白质翻译后修饰酶。它通过识别结构损伤的DNA片段而被激活,被认为是DNA损伤的感受器。研究表明,在DNA单链损伤修复过程中,XRCC1在PARP酶的作用下聚集到损伤位点。DNA 依赖蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)由催化亚单位(DNA-PK catalytic subunit,DNA-PKcs)、调节亚单位(KU,包括 Ku70、Ku80)组成,它是DNA损伤修复的重要酶,主要通过非同源性末端接合(Non-homologous end joining,NHEJ)的方式,参与 DNA 双链断裂(double-strand breaks,DSBs)的损伤修复。当DNA双链断裂,Ku70、Ku80快速的识别、结合DNA断端,激活DNA-PKcs,招募DNA连接酶IV-XRCC4复合体到DNA断端,修复连接断裂的DNA双链。研究表明,XRCC1对DNA单链损伤的修复作用,需要DNA-PK的磷酸化作用。根据以上研究,我们提出假设:XRCC1在PARP酶或DNA-PK的作用下,聚集到DNA复制叉停滞处,并促进DNA复制又停滞的重新启动。同源重组(Homologous recombination,HR)主要通过利用未受损伤的另一条染色体作为模版,来修复与其相似的受损伤的染色体。DNA单链损伤修复主要通过激活PARP酶的活性来实现。同源重组为主导的DNA双链断裂损伤修复与PARP主导的DNA单链断裂损伤修复可以互相补充代偿。在正常组织细胞中,两种修复方式共存,共同保障细胞的存活。抑制其中一种机制不会产生致命的影响;然而,在某些病变组织中(如肿瘤细胞),往往存在其中某一种修复方式缺陷,此时若阻断剩余的修复方式即可选择性地杀死病变组织细胞。这种理论被称为"合成致死"(Synthetic Lethal)。近年来,随着研究的深入,越来越多的靶向DNA损伤修复通路的小分子抑制剂被研发用于肿瘤的治疗。如PARP1抑制剂奥拉帕尼(Olaparib)已被美国食品药品监督管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)批准应于治疗同源重组修复缺陷的肿瘤患者。然而,由于同源重组修复缺陷主要见于卵巢癌、乳腺癌患者,而在其他肿瘤细胞相对较少出现,这就限制了 PARP1抑制剂的使用范围。欧夹竹桃苷(Oleandrin)是从中草药夹竹桃中提取分离出来的一种单体化合物,它具有很好的抗肿瘤作用。我们前期研究发现,欧夹竹桃苷能够诱导肿瘤细胞的DNA单链结构增多及XRCC1的表达增加,提示可能引起DNA损伤。据此,我们提出假设:欧夹竹桃苷抑制同源重组修复。如果成立,欧夹竹桃苷与Olaparib联合使用,将扩大PARP抑制剂的使用范围,为肿瘤的治疗提供一个新的策略。本实验分成两部分进行研究:(1)探求XRCC1对DNA复制叉停滞、重新启动的作用机制,及PARP1、DNA-PKcs在这个过程中对XRCC1的调控作用;(2)明确DNA损伤修复反应在欧夹竹桃苷抗肿瘤中的作用,并探求一种新的靶向DNA损伤修复反应的抑制剂。第一部分XRCC1介导DNA复制损伤修复的机制研究目的:研究XRCC1对DNA复制叉停滞的保护及其重新启动的影响,并探讨PARP1、DNA-PKcs 对 XRCC1 的调控作用。方法:(1)为了探讨XRCC1在DNA复制叉停滞处表达,我们用羟基脲(Hydroxyurea,HU)干预人的骨肉瘤细胞(U20S),免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测XRCC1表达,以及XRCC1分别与5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苦(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)、细胞周期蛋白 A(Cyclin-A)的共定位情况。(2)为了探讨在DNA复制叉停滞时,PARP1对XRCC1的调控作用,我们用HU与Olaparib—起干预U20S细胞,免疫荧光检测XRCC1焦点(foci)的形成,观察当PARP1的活性被抑制以后,XRCC1的表达。(3)为了探讨XRCC1在DNA复制叉停滞处的聚集,对DNA复制叉停滞的保护及其重新启动的作用,我们用HU干预EM9-V(XRCC1基因缺陷)、EM9-XH(XRCC1表达正常)细胞,DNA纤维形成实验(DNAfiber)检测DNA复制叉停滞和重新启动的情况;(4)克隆形成实验,检测在HU的复制压力作用下,XRCC1对细胞增殖的影响;(5)为了明确RAD51对DNA复制叉停滞的保护作用,我们用HU干预U20S细胞,蛋白质免疫印迹实验(western blot)检测RAD51的表达;(6)为了明确Mre11对XRCC1表达的影响,我们用Mirin(Mre11抑制剂)干预U20S细胞,HU干预EM9-V、EM9-XH细胞,免疫荧光分别检测XRCC1、Mre11的表达;Mirin干预EM9-V、EM9-XH细胞,克隆形成实验检测在XRCC1、Mre11都缺陷的情况下,细胞的增殖状况。并采用Mirin与Olaparib共同干预U20S细胞,免疫荧光检测PARP1对Mirin诱导的XRCC1表达的影响;(7)为了观察蛋白激酶2(Casein Kinase 2,CK2)对XRCC1表达的影响,我们用HU干预EM9-V、EM9-XH、EM9-CKM细胞,western blot检测XRCC1的表达;在HU干预的U20S细胞中,加入CK2抑制剂 TBB,western blot 检测 XRCC1 的表达;(8)为 了检测 DNA-PKcs 对 XRCC1的影响,我们用HU干预DNA-PKcs缺陷的V3-3细胞和野生型的AA8细胞,免疫荧光检测XRCC1焦点的阳性细胞;DNA-PKcs特异性的siRNA基因沉默U20S细胞的DNA-PKcs,再用HU干预,western-blot检测XRCC1表达;HU处理GFP-XRCC1-U20S细胞,检测XRCC1与DNA-PKcs共定位情况;(9)为了进一步研究XRCC1在DNA-PKcs的作用下,对DNA复制叉的影响,我们用siRNA基因沉默EM9-V和EM9-XH细胞的DNA-PKcs,然后进行DNA fiber实验,检测DNA复制叉的停滞和重新启动情况。结果:(1)在HU的复制压力作用下,XRCC1焦点阳性细胞的百分比增加,XRCC1焦点与EdU共定位,且仅仅在Cyclin-A阳性的细胞中表达,表明XRCC1在DNA复制叉停滞处聚集;(2)PARP1的活性被抑制,HU无法诱导XRCC1的表达增加,表明XRCC1在DNA复制叉停滞处的聚集依赖于PARP1的调控作用;(3)与EM9-XH细胞相比,EM9-V细胞的DNA复制叉停滞百分比显著增高,表明XRCC1可以保护停滞的DNA复制叉并促进其重新启动;(4)在HU的复制压力作用下,EM9-V细胞的克隆形成受到抑制,而EM9-XH细胞的克隆形成无明显影响,提示在HU作用下,XRCC1可以促进细胞的存活;(5)在HU的作用下,XRCC1的表达在2h较高,而RAD51在24h表达较高,提示随着DNA复制叉停滞时间的延长,RAD51介导的同源重组修复可能参与DNA复制叉停滞的修复;(6)Mre11抑制剂Mirin可以诱导U20S细胞XRCC1表达增加;在HU的作用下,EM9-V细胞中Mre11表达显著高于EM9-XH细胞,提示Mre11也参与了对DNA复制叉停滞的修复;(7)当CK2活性被抑制以后,HU无法诱导XRCC1的表达增加,提示XRCC1的表达要依赖CK2的磷酸化作用;(8)在DNA-PKcs缺陷的V3-3细胞,HU无法诱导XRCC1的表达增加;免疫荧光检测发现,XRCC1与DNA-PKcs共定位,表明XRCC1的表达要依赖DNA-PKcs的调控作用;(9)DNA-PKcs被基因沉默以后,DNA复制叉停滞增加,表明DNA-PKcs保护停滞的DNA复制叉,并促进其重新启动。结论:(1)XRCC1在PARP1、DNA-PKcs的调控作用下,募集到DNA复制叉停滞处,保护停滞的DNA复制叉,并促进其重新启动;(2)XRCC1在DNA复制叉处的聚集,可以促进细胞的存活;(3)XRCC1的表达依赖于CK2的磷酸化作用;(4)Mre11、RAD51可以保护停滞的DNA复制叉。第二部分DNA损伤修复反应在欧夹竹桃苷抗肿瘤作用机制中的研究目的:探讨DNA损伤修复反应在欧夹竹桃苷抗肿瘤作用中的机制,并寻求一种新的同源重组抑制剂。方法:(1)为了探讨欧夹竹桃苷的抗肿瘤作用,我们体外培养肺癌细胞(A549、H1299),予以欧夹竹桃苷干预,流式细胞仪检测细胞的凋亡;(2)为了探讨欧夹竹桃苷对DNA损伤的影响,我们体外培养A549、H1299细胞,予以欧夹竹桃苷干预后,免疫荧光、westernblot检测RPA、γH2AX表达;(3)为了探讨欧夹竹桃苷对DNA损伤修复通路的影响,我们体外培养A549、H1299细胞,予以欧夹竹桃苷干预后,western blot检测RAD51、XRCC1的表达;(4)为了检测欧夹竹桃苷对细胞周期的影响,我们体外培养A549细胞,予以欧夹竹桃苷干预后,流式细胞仪检测细胞周期的阻滞情况;(5)为了验证欧夹竹桃苷对同源重组修复的影响,我们用XRCC1特异性的siRNA基因沉默A549细胞的XRCC1基因,然后予以欧夹竹桃苷干预,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:(1)欧夹竹桃苷干预后,肺癌细胞的凋亡率明显增加,增殖受到抑制;(2)欧夹竹桃苷可以诱导肺癌细胞的DNA损伤蛋白RPA、γH2AX表达增加;(3)欧夹竹桃苷诱导肺癌细胞的RAD51表达降低,XRCC1的表达增加,表明欧夹竹桃苷可以抑制同源重组修复,活跃DNA单链损伤修复;(4)我们用XRCC1特异性siRNA基因沉默XRCC1后,肺癌细胞对欧夹竹桃苷的敏感性增强、细胞生长明显受到抑制,进一步验证了欧夹竹桃苷对同源重组修复通路的抑制作用,及"合成致死"理论。结论:(1)欧夹竹桃苷可以诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长,具有一定的抗肿瘤作用;(2)欧夹竹桃苷的抗肿瘤作用与DNA损伤有关;(3)欧夹竹桃苷可以抑制同源重组修复,可能是一种有效的同源重组抑制剂。