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精子蛋白17(sperm protein 17,Sp17)是一种睾丸特异性蛋白,最初是作为一种精子自身抗原成分从兔睾丸的精子膜和睾丸膜沉淀物中分离得到,是一种高度保守的哺乳动物蛋白质。研究发现Sp17在睾丸中表达丰富,在前列腺中仅有微弱表达,而其他组织包括脑、结肠、心脏、肾脏、肝脏、肺、胰腺、骨骼肌、脾、骨髓则未能检出Sp17基因表达。同时发现Sp17在多种恶性肿瘤如多发性骨髓瘤、卵巢癌、食管癌、神经系统肿瘤、鼻腔神经胶质瘤等中有高水平的表达,被认为属于肿瘤/睾丸(cancer/testics,CT)抗原的一种。明确该基因的表达对肿瘤细胞生物学行为的影响,并以此为标志,来判断肿瘤性疾病的发展、转归、制定恰当的治疗方案提供了重要的参考信息。目前对Sp17的生物学功能了解的很少,其作用可能是与透明带上的糖基结合而促进受精作用,并能促进硫酸乙酰肝素介导的细胞与细胞粘附和聚集。研究发现Sp17在呼吸道以及男性和女性生殖道纤毛上皮细胞和精子尾部表达。一位日本学者将Sp17 siRNA转染卵巢透明细胞癌ES-2细胞系后,发现siRNA在抑制Sp17 mRNA表达的同时,也增强了ES-2细胞对抗癌药物紫杉醇的敏感性。这些结果提示Sp17蛋白的表达可能与肿瘤细胞的迁移、耐药性有关。为了进一步了解Sp17的异常表达对肿瘤细胞的生物学行为的影响,本课题开展了如下研究:1.hSp17/EGFP共表达载体的构建用含报告基因-增强型绿色荧光蛋白(Enhance green fluorescent protein,EGFP)基因的质粒pEGFP-N1作为真核表达载体,以带有hSp17基因的质粒pGEM-T/hSp17为模板,进行PCR扩增,获取hSp17基因片段。将纯化后的目的片段和pEGFP-N1质粒分别经HindⅢ/KpnⅠ双酶切,然后T4 DNA Ligase连接,构建hSp17的重组表达载体pEGFP-N1/hSp17,转化大肠杆菌DH5α,进行质粒的扩增。采用两种方法鉴定重组质粒:一种是菌落PCR,即挑取单菌落作为模板进行PCR扩增;一种是提取质粒后进行双酶切。两种方法均得到与原克隆片段大小相等的条带后,经DNA序列测定进一步证实。2.稳定共表达hSp17/EGFP的卵巢癌细胞模型的建立采用脂质体转染的方法将鉴定正确的重组质粒转染到卵巢癌HO8910细胞中,荧光倒置显微镜下观察hSp17/EGFP融合蛋白的表达,RT-PCR检测hSp17 mRNA的表达,流式细胞术与Western blot检测hSp17蛋白的表达。最后用G418进行筛选,获得稳定表达hSp17/EGFP的细胞株HO8910/hSp17,同时筛选稳定表达EGFP的细胞株HO8910/EGFP作为阴性对照。体外长期传代培养和液氮冻存复苏后,细胞生长状态良好,荧光表达较强,目的分子表达稳定。3.细胞迁移性的变化采用Transwell小室装置,利用小室底部聚碳酸酯膜上下营养成分的差异促使细胞迁移,将穿过膜的细胞用结晶紫染色,显微镜下计数,比较HO8910/hSp17细胞与HO8910/EGFP细胞迁移率的差别。4.细胞药物耐受性变化分别将2×10~4个HO8910/hSp17与HO8910/EGFP细胞接种于96孔板中,细胞贴壁后,加入培养液稀释的抗癌药物顺铂和卡铂,继续培养48h,MTT法检测细胞的存活率,依此计算HO8910/hSp17细胞对顺铂和卡铂的耐药指数。5.结论:1.成功建立hSp17与EGFP蛋白稳定共表达的卵巢癌细胞模型;2.Sp17蛋白过量表达增强了卵巢癌细胞HO8910的迁移性;3.Sp17蛋白过量表达增强了HO8910细胞对抗癌药物顺铂和卡铂的耐受性。