目的:卵巢癌因为缺乏有效的早期诊断方法,被发现时往往多为晚期,其死亡率居妇科肿瘤首位。目前,对卵巢癌患者化疗仍是最重要的辅助手段,尤其在晚期卵巢癌治疗中具有极为重要的意义。加之卵巢癌细胞在化疗过程中容易产生耐药,因此寻找更为有效的化疗方案是提高卵巢癌疗效的重要途径。目前多选用顺铂为一线化疗药物,同时由二线化化疗药物与之配伍,其中以足叶乙甙最为常用,两者可通过不同的作用机制抑制肿瘤细胞的繁殖。通过大量的研究我们对TopoII已经有了深入的了解,拓扑异构酶II(TopoII)抑制剂作为卵巢癌化疗二线药物在临床上也经常使用。TopoII和TopoIII属于同工酶,两者均可调节DNA拓扑学结构,促进DNA复制和转录,根据这些研究,我们大胆猜测,TopoIII抑制剂也可能作为化疗药物在临床得到应用。但目前对TopoIII的研究还很少,TopoIII抑制剂的研制也需更多的基础研究提供理论依据。谷胱甘肽S-转移酶-π(GST-π)是一种多功能药物代谢II相酶,GST-π不仅在人多种肿瘤组织中异常表达,而且在多种具有耐药性肿瘤细胞中过量表达,大量研究表明,GST-π是恶性肿瘤组织中升高显著且与肿瘤细胞耐药导致化疗失败关系最密切的GST同工酶。因此,检测GST-π对判断患者是否耐药,并针对不同耐药机制设计化疗方案、联合使用不同化疗药物、对提高患者的生存率有着重要的临床意义。已有研究表明,TopoIIIa在正常卵巢细胞中无表达,而在卵巢肿瘤细胞中高表达,已知CDDP可以上调TopoII,为了弄清CDDP对TopoIIIa和GST-π表达的影响,本实验选用顺铂和足叶乙甙合用,通过体外作用于卵巢癌细胞系SKOV3,采用免疫印迹方法观察用药前后对肿瘤细胞的抑制作用和肿瘤细胞内TopoIIIa和GST-π的表达,进一步了解CDDP的药物作用机理,从而减少耐药性产生,也可为TopoIIIa抑制剂的研制和临床合理配伍用药提供理论依据。方法:1细胞培养卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3为本实验室所冻存。以内含10 %胎牛血清、100 IU·mL-1青霉素、100μg·mL-1链霉素、4 mmol·L-1谷氨酰胺及1 mol·L-1 HEPES的RPMI-1640培养液,置37℃、5 % CO2条件下体外培养。2药物浓度选择、试验分组参考药物的血浆峰浓度(PSC),其中CDDP的PSC为3μg/ml;VP-16的PSC为5μg/ml,进行试验分组。实验组:(1)VP-16组:用VP-16的PSC浓度作用于细胞。(2)CDDP组:分别用CDDP的1/5PSC浓度,2/5PSC浓度,PSC浓度作用于细胞。(3)VP-16+CDDP组:用VP-16的PSC浓度分别与CDDP的上述三种浓度合用。同时设空白对照组。3核蛋白的抽提及Western blot分析3.1核蛋白的抽提及含量测定取对数生长期细胞,经0.25%胰蛋白酶消化后,加入无血清培养液吹打均匀,以1×105细胞浓度接种于高压过的无菌培养瓶中, 24h后加入药物与细胞共培养。取培养细胞2-5×106-7个/ml弃去培养液,细胞用预冷的PBS洗涤两遍;加入1ml预冷的PBS,用细胞刮刀将细胞刮下,将此混合液移入1 mL Eppendorf管中,4oC ,500g离心3min,弃上清。通过两次核裂解法裂解细胞,具体操作步骤参照(核蛋白抽提试剂盒操作步骤)。将最后所得上清转入一预冷的洁净微量离心管,即得核蛋白。用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白浓度,分装,-20℃保存,避免反复冻融。3.2 Western blot分析3.2.1上样:目的蛋白的测定取其适宜上样量,对topoIII和GST-π蛋白的测定,分别上样进行Western blot分析。在4℃条件下经10%SDS-PAGE凝胶电泳后。根据上样蛋白的分子量并依据预染蛋白分子量Marker切下大小合适的凝胶,并切去凝胶左上角标记凝胶方位。3.2.2转膜:以100 mV恒压状态下,4℃电转移2.0~3.0 h,用半干式电转移仪转至硝酸纤维素膜上.3.2.3封闭:转移结束时,取出硝酸纤维素膜(每次取出都要注意分清正反面),经5%脱脂奶4℃封闭1 h。封闭后加入一抗,兔抗人topoIII多克隆抗体,兔抗人GST-π多克隆抗体4°C孵育过夜。同样用TPBS洗膜3次,每次10 min,加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶1000)二抗,37℃孵育1h。3.2.4显色:反应结束后,取出硝酸纤维素膜,同前,用1×TBS洗膜3次,每次10 min,将膜从1×TBS液中取出,在滤纸上吸干,置干净小平皿中,用ECL或DAB显色后分析结果。4统计学方法:所有资料均用计算机统计软件SAS8.0进行统计分析。实验数据以均数±标准差(X±S)表示,组间比较采用单因素方差分析,蛋白印迹试验应用HPIAS-1000系统进行条带峰值面积和光密度定量。判断标准:以P<0.05,为有统计学意义。结果:Western blot分析显示,在110 kD和26kD位置附近出现TopoⅢa和GST-π的蛋白条带,光密度值分析结果显示(见table2、3):1 GST-π蛋白的表达:不同浓度顺铂作用后,GST-π蛋白表达量均明显高于对照组( 1/5CDDP :2.17±0.05;2/5CDDP:2.41±0.05;CDDP:2.78±0.04 vs对照:1.76±0.03),,差异有显著性,P<0.01。同时发现不同作用浓度的顺铂组间比较, GST-π蛋白表达量依次增加,经统计学分析,差异有显著性,P<0.01。VP-16作用组与对照组相比,GST-π蛋白于药物作用后表达量升高( 2.31±0.03 vs 1.76±0.03),差别有显著性,P<0.01。两药合用的组GST-π蛋白的表达量均有增加,与对照组相比,差异有显著性VP-16+1/5CDDP(1.89±0. 04)、VP-16+2/5CDDP(1.98±0.04)、VP-16±CDDP(2.11±0.05),与对照组(1.76±0.03),P<0.01。(Fig.1 A B)2 TopoⅢa蛋白的表达:不同浓度顺铂作用后,TopoⅢa蛋白表达量均明显高于对照组,经统计分析,三组与对照组相比,差别均有显著性(1/5CDDP:1.21±0.06;2/5CDDP:1.41±0.06;CDDP:1.71±0.10 vs对照:0.91±0.07),P<0.01。不同浓度顺铂组间比较,差别有显著性,P<0.01,且随顺铂浓度的增高,TopoⅢa蛋白的表达依次增强(见Fig1 B)。单用VP-16作用组,TopoⅢa蛋白的表达则明显低于对照组(0.71±0.05vs 0.91±0.07),差别有显著性,P<0.01。而两药合用的三组VP-16+1/5CDDP(1.02±0.04)、VP-16+2/5CDDP( 1.14±0.02 )、VP-16±CDDP ( 1.27±0.04 ),与对照组(0.91±0.07)相比,TopoⅢa蛋白的表达量略有升高,经统计学处理,差异有显著性,P<0.01。(Fig.2 C D)结论:本试验结果表明,CDDP作用卵巢SKOV3癌细胞后,GST-π和TOPOIIIα的表达增加,VP-16可降低TOPOIIIα的表达,这对TOPOIIIα抑制剂的研究具有参考意义。根据研究表明,细胞株GST-π耐药性愈强,GST-π表达量愈高,两者合用使GST-π表达量减少说明两者合用可减少细胞的耐药性。如此,我们可以通过进一步了解CDDP作用机理、减少耐药性的发生,提高卵巢癌患者生存率,而且对其他肿瘤的治疗也有借鉴作用。