论文部分内容阅读
肝纤维化(liver fibrosis)是由病毒性肝炎、胆汁淤积、非酒精性脂肪肝炎等慢性肝脏疾病过程中细胞外基质的过度积累导致的,晚期肝纤维化会导致肝硬化、肝衰竭、门静脉高压等疾病,严重威胁患者生命健康。肝纤维化病理机制复杂,目前尚无疗效明确的药物可供临床应用。天然产物能通过多靶点治疗肝纤维化,已成为近年来防治肝纤维化研究的热点。人工培养基培养的蛹虫草称为虫草花。蛹虫草多糖具有抗氧化、降血糖、抗病毒等生物活性,相比蛹虫草,虫草花价格低廉,且多糖含量更高,因此可能具有更高的利用价值。本文以虫草花为原料,探究其最佳提取工艺,并通过体内研究探究其对小鼠肝纤维化的作用与机制。本研究通过水提醇沉法提取粗多糖,利用响应面分析法优化多糖提取工艺,通过Sevag法除蛋白,得到纯度为95.61%的虫草花多糖;以C57BL/6J小鼠为研究对象,采用四氯化碳(CCl4)诱导肝纤维化动物模型,给予虫草花多糖喂食,实验结束后提取小鼠血清和肝脏组织研究虫草花多糖对肝纤维化的作用及机制。通过本课题的完成,可以得到以下结论:(1)选取提取温度、液料比、提取时间三个因素,在单因素实验的基础上,通过响应面分析法设计实验,优化虫草花多糖的提取工艺,得到最佳工艺参数为:提取温度87℃、液料比41:1(m L/g)、提取时间170 min,此条件下虫草花多糖得率为(6.21±0.22)%。(2)细胞实验证明虫草花多糖无明显细胞毒性,具有高度安全性。(3)体重是衡量实验小鼠是否健康的重要指标,腹腔注射CCl4导致小鼠体重下降,而与模型组相比,虫草花多糖喂食显著增加小鼠体重。小鼠血清肝功能检测结果表明虫草花多糖喂食显著降低CCl4诱导的AST、ALT水平上调。肝脏组织切片H&E染色结果发现,虫草花多糖喂食能够明显改善小鼠肝脏损伤程度。综上,CCl4诱导小鼠发生了较严重的肝损伤,而虫草花多糖能够明显抑制CCl4导致小鼠肝损伤。(4)本文通过天狼星红染色检测肝脏纤维化水平,发现虫草花多糖能够明显抑制由CCl4造成的肝脏组织胶原纤维沉积。肝纤维化相关蛋白水平也类似,即模型组小鼠肝脏I型胶原蛋白(collagen type I,collagen-1)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达量显著高于对照组小鼠,虫草花多糖喂食能够明显抑制这些蛋白的表达。以上结果共同表明虫草花多糖降低小鼠肝纤维化水平。(5)炎症在肝纤维化过程中发挥关键作用。本研究中,模型组小鼠肝脏肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)蛋白表达水平显著高于对照组小鼠,而在虫草花多糖组小鼠肝脏中被显著抑制。此外,本研究还发现虫草花多糖喂食能够明显上调另一核转录因子,过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ)的激活。上述结果表明虫草花多糖能够通过抑制NF-κB同时促进PPARγ的表达,抑制炎症反应,进而改善小鼠肝纤维化。(6)进一步,本研究还发现模型组小鼠肝脏B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)蛋白表达水平显著下调,BCL-2相关X蛋白(BCL2-associated X protein,BAX)蛋白表达水平显著上调;虫草花多糖组小鼠肝脏BCL-2蛋白表达水平相较模型组显著上升,而BAX则显著下降。表明虫草花多糖通过抑制CCl4诱导的细胞凋亡,从而改善肝纤维化。综上,通过本研究的完成,确定了虫草花多糖的抗纤维化作用。在机制上,认为虫草花多糖能够通过抑制炎症和凋亡发挥肝脏保护功能,为其临床应用提供理论依据。