新疆沙冬青AnGolS2基因的克隆及表达调控研究

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:xmzhkj
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近几年对植物抗逆性的研究已经越来越深入,而植物对逆境的应答及适应的机理也越来越受到人们的关注。植株在面对逆境时会做出相应的应答,从而更好地适应恶劣的环境(包括低温、高盐、干旱等等)。而启动子在调控基因的表达中起到了重要的作用,因此对基因启动子与逆境应答机理的关系研究逐渐成为热点。本研究选用了新疆沙冬青为实验材料,运用基因克隆技术,成功的克隆了An GolS2以及该基因的启动子,并且利用软件预测了该启动子的顺式作用元件,根据顺式作用元件设计缺失载体,最后进行瞬时表达分析,得到的试验结果如下:1.根据干旱胁迫转录组中找到的GolS基因的EST序列设计该基因特异性引物,用RACE扩增技术,以cDNA为模板对基因3’端及5’端进行扩增,之后对序列进行测序及拼接,得到基因全长序列1168 bp,其中编码区为987 bp。2.根据AnGolS2的编码区设计特异性引物,以新疆沙冬青DNA为模板,利用染色体步移技术,克隆得到821 bp的启动子序列,然后通过PLACE和plant CARE网站进行预测分析,得到顺式作用元件。预测结果表明该启动子序列除了TATA-Box和CAAT-Box等核心元件,还含有一些与非生物胁迫及激素应答相关的顺式作用元件。3.对新疆沙冬青的根茎叶三个部位进行低温、高盐和干旱胁迫的不同时间处理后进行实时荧光定量,发现在不同逆境胁迫下根茎叶中AnGolS2基因的表达量发生了不同的变化,推测An GolS2可能涉及到叶片光合产物的运输和储存过程。用ABA、IAA、NAA、GA3、MeJA、ETH对新疆沙冬青植株进行诱导后进行荧光定量分析,发现在不同的激素诱导下An GolS2基因的表达量发生变化,因此我们推测激素可能涉及到An GolS2基因表达调控。4.构建乙烯相关元件的缺失载体,含有乙烯元件的缺失体(385 bp),不含有乙烯元件的缺失体(378 bp),将两个缺失体和启动子全长序列一同连接到表达载体p CAMB IA 3301上,得到三个重组表达载体。利用农杆菌介导转化的方法,以GUS基因为检测报告基因进行瞬时表达分析,结果表明:注射含有乙烯元件的启动子缺失片段表达载体的叶片经过乙烯诱导后有显色反应,注射不含有乙烯元件的启动子缺失片段表达载体的叶片用乙烯诱导后无显色反应,不用乙烯诱导的叶片无论注射哪个启动子缺失片段表达载体都没有颜色,说明An GolS2启动子上的这个乙烯转录因子结合位点可能对An GolS2基因的表达有调控作用,但这一元件的启动作用明显低于全长启动子,暗示在全长启动子的其它部位可能还存在着响应乙烯诱导的顺式作用元件。
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