支气管哮喘（Bronchial asthma）是全世界最常见的慢性呼吸道疾病之一，其发病率呈逐年上升趋势[1-2]，严重威胁着儿童健康。哮喘发病机制复杂，既往研究认为与Th1亚群功能减弱，Th2亚群功能增强有关，最近研究发现一种独立于Th1、Th2细胞存在的辅助性T淋巴细胞即Th17，参与了哮喘的发生发展。近年来，“免疫耐受”在哮喘发病机制中的地位越来越受到重视，国内外文献表明，诱导哮喘免疫耐受形成可能成为哮喘防治的新靶点。吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine2，3-dioxygenase，IDO)是一种免疫调节酶，可介导机体的免疫抑制反应，在诱导机体的免疫耐受中发挥重要作用。IDO是将色氨酸分解代谢的限速酶，可在局部组织中形成低色氨酸的环境[3]。IDO沿着犬尿氨酸途径将色氨酸降解成L-犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸、尼克酰酸等一系列的代谢产物发挥作用[4]。IDO在自身免疫性疾病、器官移植、肿瘤、妊娠过程中保护胎儿免遭母体排斥等方面研究较多，而在支气管哮喘发病机制中的研究较少，故我们建立尘螨哮喘小鼠模型，探讨IDO在哮喘发病机制中的作用。　　在致敏原选择方面，本课题组既往均是采用卵清蛋白（OVA）作为变应原建立哮喘模型，但存在一定的缺陷，而尘螨是哮喘最常见的变应原之一，以尘螨制作的哮喘模型与人类哮喘的病变过程相似，能更好的模拟哮喘发病机制中各种炎性因子、组织结构的变化。故本实验通过建立尘螨哮喘小鼠模型，观察小鼠病理学、支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage fluid BALF）中炎症细胞数，检测血清及BALF液中IL-17和IFN-γ水平、肺组织中IDO蛋白的表达，探讨IDO在哮喘发病中的作用及与IL-17、IFN-γ的关系，以期从免疫耐受方面着手，为支气管哮喘的免疫治疗拓宽思路，寻找哮喘治疗中的新靶点。　　目的　　检测哮喘小鼠肺组织内IDO的表达水平，探讨哮喘小鼠肺组织中IDO的表达与血清、BALF中IL-17、IFN-γ水平之间的关系及布地奈德对其的影响，以及IDO在支气管哮喘发病机制中对免疫耐受的影响及意义。　　材料和方法　　1实验小鼠分组和哮喘模型制作方法　　SPF级、健康、6周龄、雌性BALB/c小鼠21只(购自河南省实验动物中心，合格证号SCXK（豫）20100002)。实验前称重，依随机数字表法将实验小鼠分为对照组、哮喘组、布地奈德干预组，每组7只制备动物模型。致敏阶段：哮喘组及干预组：第1天皮下注射2000 U/m l尘螨提取液100μl,第3、5、7天腹腔注射2000 U/m l尘螨提取液100μl共3次,第9、11、13天腹腔注射4000 U/m l尘螨提取液50μl共3次（注：每ml尘螨提取液中氢氧化铝含2％）；对照组则用相同致敏方法、同等剂量的生理盐水替代致敏小鼠；激发阶段：第15、16、17天，用4000 U/m l尘螨提取液50μl/次，缓慢滴鼻,1次/d，滴鼻前以0.3%戊巴比妥0.3m l腹腔注射麻醉小鼠。干预组：每次激发前，给予布地奈德混悬液lmg（2ml）雾化吸入30分钟，余同哮喘组；对照组：用同等剂量的生理盐水滴鼻激发。　　2小鼠支气管肺泡灌洗术及肺组织标本处理　　各组小鼠均在末次滴鼻激发24h后，0.3%戊巴比妥0.3 ml腹腔注射麻醉动物后，立即取眼球放血，收集血液于EDTA抗凝管中，3000r/min离心10min，取血清于-20℃冰箱保存备用；迅速剥离肺，结扎左肺根，取左肺作为标本，置于-80℃冰箱中，留做Western bolt蛋白印迹，以24G静脉留置套管针行右支气管插管并进行灌洗，以1mL注射器抽吸0.8mL生理盐水注入气管，停留30秒后回抽，重复灌洗3次，最后可回抽出1.0-1.8mL的生理盐水，回收率＞80%，转移至EP管中，以3000r/min将肺泡灌洗液离心10min，取上清液用于细胞因子检测，细胞沉淀经100ul生理盐水重悬后用细胞计数板计算白细胞总数，取右肺组织，双蒸水冲洗甲醛固定后石蜡包埋切片，分别行HE染色及免疫组化染色。　　3 HE染色　　取甲醛固定过的右肺组织，制备蜡块、切片、烤片，然后脱蜡、水化，进行苏木精-伊红染色等，制备成HE染色玻片，在显微镜下观察同等级别支气管周围炎症细胞浸润情况及支气管壁形态学改变和测定同等级别的支气管壁厚度（制作过程严格按HE染色法步骤操作）。　　4免疫组化染色　　将小鼠肺组织石蜡切片、烘烤，自然冷却，经固定水、石蜡包埋、冰冻切片，制成3μm厚的切片。放入二甲苯溶液中重复脱蜡2次、脱水、加入抗原修复液进行修复、封闭内源性过氧化物酶、加入1：100的nIDO一抗，孵育，4℃过夜；滴加二抗、孵育、而后脱水封片等，制作时严格按照免疫组织化学染色步骤操作。应用计算机病理图像分析系统，在显微镜高倍镜（10×40）下观察并测定阳性细胞中蛋白的表达。每张切片随机择取5个高倍镜视野范围，结果以其平均值单位面积累积光密度(IOD)值表示。　　5 ELISA法检测血清及BALF液中IL-17、IFN-γ水平　　将保存于-20℃冰箱的小鼠血清及BALF上清液取出，严格按照IL-17、IFN-γELISA试剂盒说明书操作。　　6 Western blot蛋白印迹法检测IDO蛋白表达　　取-80℃冰箱冻存的小鼠左肺组织，称取肺组织重量1g，加入组织蛋白抽提试液提取蛋白，用预冷的匀浆研磨器处理1-2min，对标本进行编号，置于冰上孵育30min，离心15-20分钟，收集上清，-20℃保存。考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白(BSA)进行蛋白定量，分装，-20℃冰箱保存，配制15%的聚丙烯酸胺凝胶，将溶液注入玻璃板夹层中，至少聚合30min，100℃水浴5min、离心5min，加点样孔和蛋白Marker，然后电泳。考马斯亮蓝R-250、丽春红染色液进行染色，在摇床上脱色至蛋白条带清晰，将胶浸入事先准备好的转膜缓冲液中进行转膜，转膜完成后脱脂奶粉封闭，室温摇床上缓慢摇动2 h，然后置于10mL1:1000脱脂奶粉稀释的一抗中，4℃过夜，弃去带有一抗的封闭液，行二抗孵育，然后曝光显影。　　7统计分析　　应用SPSS17.0统计软件行数据分析。各组数据分析以均数±标准差（(x)±s）表示，组间样本均数差异性比较则采用单因素方差分析，LSD-t法进行两两比较，两个因素之间采用Pearson相关性分析，α=0.05为检验标准。　　结果　　1实验动物一般情况观察　　哮喘组小鼠经过尘螨提取液反复滴鼻激发后，出现明显呼吸急促、头面部瘙痒、前肢缩抬、弓背、烦躁等哮喘急性发作表现，非激发期有饮水、排便等增加。布地奈德干预组也出现与哮喘组相似的症状，但表现较哮喘组轻。对照组小鼠呼吸平稳，行为和饮食均未见异常。　　2小鼠肺组织病理学改变　　哮喘组小鼠：气道壁厚度增加，气道上皮细胞脱落、杯状细胞化生、胶原纤维增生，可见大量炎细胞浸润，以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞为主。干预组小鼠：气道炎症与哮喘组相似，但程度明显较轻。对照组小鼠：气道壁厚度正常，无杯状细胞化生，可见散在炎症细胞、管腔无狭窄。3组小鼠气道壁厚度示哮喘组较干预组及对照组增高，干预组高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。（见附图4.1，见表4.1）　　3支气管肺泡灌洗液细胞计数及分类　　结果显示哮喘组BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞数、淋巴细胞数与干预组、对照组相比明显升高，干预组高于对照组，两两比较差异有统计学意义（P<0.05）。（见表4.2）　　4各组小鼠肺组织IDO免疫组化结果　　免疫组化显示褐色区为阳性细胞区。结果显示IDO主要存在于小鼠支气管壁、小血管壁周围，阳性区积分光密度平均值显示哮喘组IDO表达低于干预组和对照组，干预组IDO表达低于对照组，三组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。（见表4.3，图4.2）　　5血清及BALF液中IL-17、IFN-γ的水平　　哮喘组小鼠血清中IL-17水平与干预组、对照组相比升高，干预组高于对照组，（F=65.15 P<0.05）差异有统计学意义，哮喘组血清中IFN-γ水平较干预组和对照组降低，干预组低于对照组，（F=107.31 P<0.05）差异有统计学意义；小鼠BALF中IL-17水平哮喘组高于干预组和对照组，干预组较对照组升高，（F=22.23，P＜0.05）差异有统计学意义；3组小鼠BALF中IFN-γ水平差异有统计学意义，进一步进行两两比较，哮喘组（1.53±0.30）较干预组（3.9±2.88）和对照组（11.92±4.19）降低，干预组低于对照组。（见表4.4、表4.5）　　6小鼠肺组织中IDO蛋白表达结果　　各组的IDO/内参灰度比值分别为:哮喘组、干预组的蛋白表达量较对照组明显降低(F=5.31 P<0.01)，干预组低于对照组(F=5.31 P<0.01)。（见表4.6，图4.3）。　　7相关性分析　　Pearson相关分析显示：血清中IL-17水平与BALF中IL-17水平呈正相关（r=0.921，P<0.01），血清中IFN-γ水平与BALF中IFN-γ水平呈正相关（r=0.981， P<0.01）；血清中IL-17水平与IFN-γ水平呈负相关（r=-0.933，P<0.01）；BALF中IL-17水平与IFN-γ水平呈负相关（r=-0.905，P<0.01）；肺组织内IDO蛋白的表达与血清中IL-17水平呈负相关（r=-0.916，P<0.01），与血清中IFN-γ水平呈正相关（r=0.956，P<0.01）；肺组织内IDO蛋白的表达与BALF中IL-17水平呈负相关（r=-0.905，P<0.01），与BALF中IFN-γ水平呈正相关性（r=0.963， P<0.01），见图4.4-4.11。　　结论　　1．哮喘小鼠肺组织中IDO的低表达，利于支气管哮喘形成和发展；　　2．IDO能抑制IL-17反应减轻或抑制气道炎症；　　3．在实验小鼠血清及BALF中IFN-γ水平与肺组织中IDO表达呈正相关，提示IFN-γ能诱导IDO的表达；　　4．吸入性糖皮质激素可上调小鼠肺组织IDO蛋白的表达水平。