代谢性肌病是一组常被临床误诊的骨骼肌疾病,临床表现复杂多样,需要进行病理学、生化代谢和酶学检查加以确诊。骨骼肌是一个需要大量能量持续供应的器官,肌纤维内糖原和脂肪酸是分别是肌肉短期和长期主要能量来源,因此糖元代谢和脂肪酸代谢异常会导致以肌病为主的全身多系统代谢紊乱,并且许多遗传性或获得性骨骼肌疾病都与糖元和脂肪酸代谢异常有关。近年来病理、生化和分子诊断方法的普及应用,大大提高了代谢性肌病的确诊率。本研究主要对脂肪酸代谢异常引起的肌病,包括核黄素反应性脂质沉积性肌病和单纯肌病型中性脂肪贮积症这两种主要的脂质沉积性肌病进行临床,病理,,生化,分子和治疗手段的深入探讨。脂质沉积性肌病(Lipid storage myopathy, LSM),是由于脂肪代谢过程中多种酶的功能缺陷或肉碱的缺乏,影响了肌纤维内的脂肪酸代谢,导致异常增多的脂滴在肌纤维内堆积而引起一组病理综合征[1]。LSM不是一个独立的疾病实体,是一组由多种脂肪代谢缺陷所致的疾病的统称。该组疾病主要有两种表现形式,一是光镜下可见肌纤维内有大量的脂滴沉积,临床表现为进行性肌肉无力和运动不耐受,即指的“脂质沉积性肌病”[2]；另一种是肌纤维内罕见脂滴沉积,而临床主要表现为运动、饥饿或感染等应激条件下诱发的反复发作的急性横纹肌溶解,或者仅表现为慢性持续性的肌无力[3]。至今国内文献已有大量LSM病例报道。与其他国家相比,本病在我国的发病率较高,国外LSM报告较少[4],远远低于我国的比例。目前LSM的病因主要包括三大类[5]：①原发性肉碱缺乏(Primary carnitine deficiency, PCD);②多种酰基脱氢缺陷(Multiple acyl CoA dehydrogenation deficiency, MADD),即戊二酸尿症Ⅱ型(Glutaric aciduria type Ⅱ, GAII);③细胞浆内甘油三酯代谢障碍,包括三酰甘油水解过程的上游水解酶PNPLA2基因(又称ATGL的基因)突变导致的单纯肌病型中性脂肪贮积症(Neutral lipid storage disease with myopathy, NLSDM)[6]以及由ATGL的活化蛋白CGI-58基因(又称ABHD5基因)突变导致的中性脂肪贮积症伴鱼鳞病(Neutral lipid storage disease with ichthyosis, NLSDI),后者又称Chanarin-Dorfman综合征。此外,部分肉碱棕榈酰转移酶Ⅱ(Carnitine palmitoyltransferase, CPTII)缺乏的患者也表现为LSM[5]。本文主要探讨我国两种主要的LSM(MADD和NLSDI)的临床特点、生化和病理诊断、分子机制及其治疗手段。本研究不仅对代谢性肌病的诊断和治疗具有重大提示作用,还有利于遗传性肌病患者的优生优育,同时有助于探索核黄素在能量代谢障碍性疾病和神经退行性疾病中的潜在治疗作用。第一部分脂质沉积性肌病患者的临床、病理和生化分析本研究选取1995-2011年间来齐鲁医院神经内科就诊的64例LSM患者。所有患者均行肌肉组织冰冻病理检查,24例患者采集适量新鲜尿液,29例患者取无名指末梢血,分别行尿有机酸和血脂酰肉碱生化分析。本研究所采用的正常对照系因肌无力行肌肉活检,而实验室检查和肌肉病理诊断为大致正常的个体。根据患者临床表现、肌肉病理、生化分析和核黄素治疗的效果,这些患者分两组。第一组：61例患者临床表现为单纯近端为主的对称性肌无力和运动不耐受,伴有不同程度高肌酸激酶(Creatine kinase, CK)血症和肌痛,但是没有发作性脑病及其他脏器受累的症状和体征。病理染色见大量脂滴在肌纤维内沉积[2],以Ⅰ型纤维为主。患者发作期尿有机酸分析发现异常增多的二羧酸,乙基丙二酸,2-羟基戊二酸；酰基肉碱分析显示中长链酰基肉碱明显增高。其中41例LSM患者采用单一核黄素(维生素B2)治疗后肌无力症状明显改善(称为核黄素反应性LSM)[7]。第二组：另外3例虽然也表现为单纯性肌无力和运动不耐受,但是近端肌群不如远端肌群受累明显,并且存在受累肌群的不对称性。患者活检标本除脂滴沉积外,局部可见镶边空泡[4,8]。尿有机酸和血脂酰肉碱分析大致正常。对组二3例单纯肌病型中性脂肪贮积症的患者,进一步抽取外周血涂片行病理染色检查,在所有患者外周血白细胞内均可见脂肪增多,即Jodan阳性。第二部分脂质沉积性肌病的基因突变分析为了找出本组患者的致病基因,我们对全部64例LSM患者进行候选基因分析。PCR扩增LSM相关基因ETFDH (Electron transfer flavoprotein dehydrogenase), ETFA (Electron transfer flavoprotein, a subunit), ETFB (Electron transfer flavoprotein, β subunit), ACADM (Acyl-CoA dehydrogenases, medium-chain), PNPLA2(Patatin-like phospholipase domain-containing protein2)和MFT (Mitochondrial folate transporter)的所有外显子以及内含子外显子交界区,并做序列分析。对于基因组PCR未发现突变者,再进一步提取总RNA,反转录后行cDNA全长扩增和测序。结果发现,临床表现为核黄素反应性LSM的61例患者,有57例带有ETFDH基因突变,符合MADD的分子诊断。并且ETFDH基因突变形式多样,以复合杂合突变为主,突变位点多位于蛋白的黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide, FAD)结合域,突变人群存在2个热点突变,为c.770A>G和c.1227A>C,出现频率分别为21次和15次。其余4例核黄素反应性LSM未发现相关候选基因的突变；临床表现为远端不对称受累为主的3例脂质沉积性肌病患者,全部携带PNPLA2基因突变,符合单纯肌病型中性脂肪贮积症的分子诊断。同时对患者ETFDH基因突变热点c.770A>G和c.1227A>C进行单体型连锁分析。根据软件计算结果,c.770A>G不属于任何一个单体型块(haplotype block),即使存在奠基者,在遗传过程中该区域发生的基因重组频率太高,无法进行连锁不平衡的计算；c.1227A>C突变的分析结果未证实存在奠基者效应(foundereffect)第三部分核黄素反应性脂质沉积性肌病的突变蛋白ETF：QO对其辅基FAD和CoQ10的影响电子转运黄素蛋白(Electron transfer flavoprotein, ETF)接受上游脂肪酸氧化脱氢反应产生的电子,然后电子在辅基FAD的帮助下传递给电子转运黄素蛋白泛醌氧化还原酶(Electron transfer flavoprotein ubiquinone oxidoreductase, ETF:QO),通过辅酶Q10(CoenzymeQ10, CoQ10)而进入呼吸链,最终与氧结合生成水[9,10]。为了进一步明确ETFDH基因突变的分子特点,对其中17例ETFDH基因突变LSM患者进行突变蛋白ETF:QO的免疫印迹分析,并将突变患者的ETF:QO蛋白表达量与正常对照相比较。结果发现LSM患者体内ETF:QO蛋白的表达量仅有轻度下降。既然突变没有导致蛋白表达量的减少,因此突变是如何影响脂肪酸的代谢过程,还是值得我们进一步深入研究的。为了探讨ETF:QO蛋白突变导致的分子病理过程,我们采用免疫沉淀法分离10例ETFDH基因突变患者的ETF:QO蛋白,进而对沉淀的ETF:QO蛋白和与之共同被沉淀出的辅基FAD进行分别定量,计算两者的结合率,并与正常对照比较,观察ETF:QO突变对FAD辅基结合能力的影响。结果发现核黄素反应性LSM患者体内FAD与ETF:QO蛋白的结合率明显低于正常对照。而肌肉内总的FAD水平与正常对照相比无明显差异。说明ETFDH基因突变会导致FAD与ETF:QO蛋白的结合力减弱,而非肌肉内总体FAD水平的缺陷。目前已发表的文献对LSM患者肌肉CoQ10含量尚有争议[6,11,12]。为了阐明突变蛋白对下游电子传递受体CoQ10的影响,我们采用反相高效液相色谱法(High-performance liquid chromatography, HPLC)对34例ETFDH基因突变患者骨骼肌CoQ10含量进行定量分析,以便进一步阐明该病的病理机制。结果发现采用肌肉总重量和总蛋白作内参,ETFDH基因突变患者肌肉内CoQ10水平高于正常对照(p<0.001),分别为正常对照的1.92和1.64倍；而采用柠檬酸合酶做内参,ETFDH基因突变患者肌肉CoQ10水平与正常对照无统计学差异。说明前面两种数据的升高是因为肌肉内线粒体拷贝数升高导致的假象,而柠檬酸合酶是线粒体的标志性酶,以它作内参的结果,说明每一个线粒体内的CoQ10水平未发生明显变化。为了证实患者体内的线粒体拷贝数的变化,采用实时荧光定量PCR来测定肌纤维内线粒体DNA (Mitochondrial DNA, mtDNA)相对于核DNA(Nuclear DNA, nDNA)的表达量。结果证实18例ETFDH基因突变患者的mtDNA含量明显高于同年龄性别对照。同时我们还检测了CoQ10合成相关基因的mRNA表达量。CoQ10合成相关的编码基因表达量未见明显改变,而代谢调节因子过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)基因的表达量有明显升高。第四部分β受体激动剂对单纯肌病型中性脂肪贮积症患者成纤维细胞内脂滴沉积的治疗作用单纯肌病型中性脂肪贮积症(Neutral lipid storage disease with myopathy, NLSDM)是一种少见的常染色体隐性遗传病,由PNPLA2基因(Patatin-like phospholipase domain-containing protein2,又称CGI-58基因)突变导致脂肪甘油三酯脂肪酶(Aadipose triglyceride lipase, ATGL,又称]Desnutrin)功能缺陷从而引起的脂肪代谢性肌病。有报道,在体外用p肾上腺素受体激动剂干预患者成纤维细胞,可以激活激素敏感性甘油三酯脂肪酶(hormone-sensitive lipase, HSL),由此可以部分代偿并缓解PNPLA2缺陷所致的脂肪分解功能障碍。Formoterol是美国FDA批准的可用于临床治疗哮喘的长效β肾上腺素受体激动剂药物,为了观察该药物治疗前后肌纤维内的脂滴在PNPLA2基因突变患者和正常对照的变化,我们用Formoterol体外干预患者的成纤维细胞,然后进行PDA(1-pyrenedecanoic acid)对脂滴的荧光标记示踪实验和Nile red, Bodipy荧光染色对比实验,并且采用酶化学反应法紫外分光光度计测量药物干预后成纤维细胞内甘油三酯(Triglyceride, TAG)的含量。贝特类的降脂药物通过激活PPARα信号转导通路,调节外周组织如肝脏、骨骼肌的脂质代谢,降低周围循环中的脂质含量,临床用来治疗高脂血症。因此,在观察长效p肾上腺素受体激动剂药物疗效的同时,我们设置了一组苯扎贝特药物干预的平行对照,以观察不同作用靶点的药物对PNPLA2基因突变患者成纤维细胞内TAG分解作用的疗效。在未给予药物干预的情况下,正常对照细胞在PDA示踪试验的第4天,荧光信号基本消失,说明第一天PDA标记的脂滴已经被代谢出细胞外,而在PNPLA2基因突变患者,在第6天仍有大量的荧光信号残余,说明脂滴代谢过程明显慢于正常对照。Formoterol药物干涉后,正常对照细胞在PDA示踪试验的第2天,荧光信号基本消失,该代谢过程明显快于未予药物干涉组,而在PNPLA2基因突变患者,第6天残余的荧光信号强度明显弱于未予药物干涉组,说明Formoterol确实加快了患者体内甘油三酯的代谢过程。但是终末点观察实验的荧光染色显示,患者的成纤维细胞在药物干预前后的脂肪特异性荧光染色信号未见明显的变化；同时TAG试剂盒的定量分析也显示,在Formoterol处理成纤维细胞的2个药物剂量100nM,10μM和苯扎贝特的2个药物剂量100μM,1mM,于6天的观察时间段内未见明显降低。但是正常对照Formoterol的10μM和苯扎贝特的100μM剂量组在药物处理第二天可见轻度降低趋势。这说明药物对脂滴的动态平衡影响有限,可能仅在一定程度上加快脂滴代谢的速度,而对细胞内累积的脂滴的分解代谢作用缓慢,特别是在患者脂肪代谢酶缺陷的情况下,对脂滴分解的促进作用慢于正常对照,因此在PNPLA2基因突变患者的细胞,6天的观察期内无法看到显著的效果。综上所述1、本研究提示中国人LSM的病因主要是ETFDH基因突变导致的核黄素反应性MADD。另外一小部分LSM是由于PNPLA2基因突变导致的单纯肌病型中性脂肪贮积症。ETFDH基因突变以复合杂合突变为主,突变形式多样化。中国北方人群有两个热点突变c.1227A>C和c.770A>G。2、MADD患者体内FAD与突变的ETF:QO蛋白结合率的降低为其主要发病机制。患者ETF:QO蛋白突变多位于FAD结合域,因此突变可造成酶蛋白和辅因子FAD的结合能力下降。而突变蛋白的表达量未见明显下降。3、CoQ10在MADD的发病机制中不是原发因素。ETFDH基因突变患者体内CoQ10总体含量是升高的,而CoQ10主要分布于线粒体,由于本组患者线粒体水平的显著增高,因此患者的CoQ10含量在每一个线粒体内部数量是相对正常的。4、对于ETFDH基因突变导致的LSM,核黄素治疗可取得良好效果；对于PNPLA2基因突变导致的LSM,β受体激动剂有望取得良好疗效。