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前言： TRAF4是TRAF家族的一个成员。TRAF4的功能并不像其他的TRAF家族成员，其功能仍然不清楚。β-catenin在乳腺发育和肿瘤发生的过程中起到了重要的作用。β-catenin是Wnt信号传导的关键因子。Razon LM和El-Diery WS，通过酵母双杂交筛选，已经发现了TRAF4和β-catenin之间的相互作用，并且TRAF4似乎可以增强β-catenin的相关转录，以及保护β-catenin蛋白兔于被p53基因的介导的降解途径降解。这是一个有趣的发现，我们考虑TRAF4是否可以通过β-catenin影响Wnt信号通路。我们回顾文献发现，TRAF4对Wnt信号通路的影响在非洲爪蟾胚胎组织是可以忽略的。但是，TRAF4是否与Wnt信号通路在肿瘤组织中有关系，例如乳腺癌组织，仍不清楚。此外，TRAF4最初被鉴定为在乳腺癌中扩增的基因，促进了细胞的迁移和乳腺癌转移，这些功能很像β-catenin参与的功能。还有一个原因是，TRAF4可以调节NF-κB活化，Wnt信号通路和NF-κB信号通路之间存在交叉调控。 出于这些原因，我们研究TRAF4与β-catenin在乳腺癌中的表达相关性和TRAF4对β-catenin的亚细胞分布和相应的调控机制的影响，并进一步确定在乳腺癌细胞中TRAF4和Wnt信号通路之间的关系。 方法： 1、免疫组化 分析78例乳腺癌组织中TRAF4与β-catenin的表达相关性。 2、细胞培养 正常乳腺上皮细胞系MCF-10A，低转移性乳腺癌细胞系MCF-7以及高转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231。 3、免疫共沉淀 检测TRAF4与β-catenin的结合状况。 4、免疫荧光染色 检测TRAF4与β-catenin的核浆定位及其共定位。 5、转染 按照Attractene转染试剂或HiPerFect转染试剂盒细胞进行瞬时转染。 6、Western blot 应用Western blot方法检测转染TRAF4前后，β-catenin的变化:检测干扰TRAF4前后β-catenin的变化和细胞核和细胞浆内β-catenin的变化。 7、MTT 分析细胞的相对增殖能力。 8、统计分析 采用SPSS17.0统计软件对实验数据进行分析。数值以均值±标准差表示。P＜0.05为差异具有显著性。 结果： 1、TRAF4与β-catenin在乳腺癌中表达呈正相关 免疫组化分析结果显示，TRAF4与β-catenin在乳腺癌组织中表达。TRAF4在乳腺组织中呈细胞核和细胞浆表达，β-catenin呈细胞膜，细胞浆和细胞核表达。在乳腺癌中TRAF4的表达与β-catenin表达呈正相关(P＜0.05)。 2、在乳腺癌中TRAF4与β-catenin相互作用 免疫共沉淀分析发现，TRAF4与β-catenin在乳腺癌细胞中相结合。免疫荧光分析说明TRAF4与β-catenin在乳腺癌细胞中存在共定位，并验证了TRAF4和β-catenin乳腺癌细胞中的定位。 3、在乳腺癌中TRAF4促进β-catenin蛋白的表达和活化 在MDA-MB-231细胞中上调TRAF4后，β-catenin和活化β-catenin的表达量增加。在MCF-7细胞中，上调TRAF4后β-catenin蛋白总量不变，但是活化的β-catenin表达增加。 4、在乳腺癌中TRAF4促进β-catenin蛋白的核定位 免疫荧光分析MDA-MB-231细胞中上调TRAF4和下调TRAF4后，β-catenin的细胞定位。结果表明TRAF4表达上调后，β-catenin细胞核定位增加。Western blot分别分析MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞的细胞浆和细胞核内的β-catenin表达，结果发现，上调TRAF4后细胞核内β-catenin表达增加。 5、在乳腺癌细胞中TRAF4通过调节β-catenin蛋白参与Wnt信号通路 CyclinD1和c-myc是Wnt信号通路的下游靶蛋白，TRAF4上调后cyclinD1和c-myc表达增加，TRAF4表达下调后cyclinD1和c-myc表达下调。在MDA-MB-231细胞中上调TRAF4后干扰掉β-catenin可以发现cyclinD1和c-myc的表达不增加，这说明TRAF4通过β-catenin调节cyclinD1和c-myc。 6、TRAF4通过调节β-catenin蛋白的表达，促进细胞增殖 TRAF4可以促进MDA-MB-231细胞增殖，但是当上调TRAF4表达的同时下调β-catenin蛋白表达以后，TRAF4促进细胞增殖能力减弱。说明TRAF4通过β-catenin促进细胞的增殖。 7、在MCF-7细胞中，下调β-catenin蛋白不影响TRAF4表达 在MCF-7细胞中，下调β-catenin表达后，TRAF4表达量不变。说明β-catenin不影响TRAF4的表达。 结论： TRAF4与β-catenin在乳腺癌中相互作用，其在乳腺癌组织中表达呈正相关，TRAF4上调β-catenin蛋白表达和活化并促进β-catenin的核定位，在乳腺癌中TRAF4通过调节β-catenin蛋白参与Wnt信号通路。