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背景与目的:结直肠癌是世界范围内发病率第三、死亡率第二的恶性肿瘤,在我国总体发病率仅次于肺癌和胃癌。随着国民经济的快速发展、饮食结构及生活习惯的改变、老龄化社会进程的加快,结直肠癌的新发病例呈逐年上升趋势。早期结直肠癌因临床症状隐匿,多数患者确诊时已进入中晚期而延误治疗,结直肠癌的发病涉及了多个癌基因的激活以及抑癌基因的失活,公认参与结直肠癌发生发展的靶基因包括有P53、K-RAS、APC等。随着科技发展对医疗水平的提升,目前临床上对结直肠癌采用靶向治疗已取得显著疗效,但由于基因突变以及人体对靶向药物产生耐药性等因素,使得探索结直肠癌基因治疗新的靶点具有重要意义。Crk SH3域结合鸟嘌呤核苷酸交换因子(Crk SH3-domain-binding guanine-nucleotide-releasing factor,C3G)是一种针对Ras和Rap1蛋白的鸟嘌呤核苷酸交换因子,能够接受生长因子、整合素、激素、细胞因子等刺激,调节Ras和Rap1蛋白可逆性结合GTP和GDP而完成信号传递。研究表明,C3G在人体中虽然广泛表达、但存在组织特异性,如在肺癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、神经母细胞瘤中发现C3G表达上调,并参与调控细胞迁移、增殖、粘附、分化、凋亡等生物学行为,但在宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病中C3G的表达却下调。值得注意的是,不同肿瘤组织中C3G所引起效应也不尽相同,如高表达的C3G促进了卵巢癌细胞的迁移和侵袭,却抑制了乳腺癌细胞运动;而宫颈癌中C3G表达下调,却促进了癌细胞的侵袭。目前C3G在结直肠癌中的研究甚少,因此我们将要探索C3G在结直肠癌中的表达水平是否影响临床病理特征和预后,并构建C3Gi细胞系,探究C3G表达变化对细胞增殖、迁移等生物学行为的相关影响等。方法:1、通过回顾性研究,收集西南医科大学附属医院2013年7月~2014年6月手术切除的结直肠癌组织及其癌旁(距肿瘤边缘>5cm)正常组织标本69例份,2019年5~8月经手术切除的31例份结直肠癌新鲜组织及癌旁正常组织标本,分别用免疫组化法、实时荧光定量PCR技术检测以上组织中C3G蛋白及mRNA表达。对结直肠癌患者随访至2019年9月2日,分析结直肠癌组织中C3G蛋白表达情况与患者临床病理特征及预后的关系。2、使用Western Blot和RT-PCR实验检测正常结肠粘膜细胞FHC、结直肠癌细胞株HCT-116、HCT-8细胞株中C3G蛋白和mRNA含量;使用siRNA瞬时转染结直肠癌细胞株干扰C3G表达,使用荧光转染效率检测和实时荧光定量PCR筛选出干扰效果满意的siRNA,采用Western Blot实验验证C3G蛋白干扰效果,干扰成功后完成C3Gi结直肠癌细胞株构建。3、通过CCK-8法和Transwell实验比较分析C3G对结直肠癌细胞株(HCT-116、HCT-8)增殖和迁移功能的影响。结果:1、C3G在结直肠癌和癌旁正常组织中的表达情况C3G蛋白定位于细胞膜和细胞质内,阳性表现为黄色或棕黄色颗粒,在结直肠癌与癌旁组织中,C3G染色高表达阳性率分别为60.87%(42/69)和34.78%(24/69),差异具有统计学意义(χ~2=9.409,P<0.05),同时收集的31例份新鲜结直肠癌和癌旁组织中,癌组织C3G mRNA相对表达量是癌旁正常组织的(5.86±2.03)倍,差异具有统计学意义(P<0.05)。2、C3G表达情况与病理特征、预后的关系通过卡方检验分析发现,C3G高表达与结直肠癌TNM分期情况(χ~2=7.912,P=0.005)、肿瘤浸润深度(χ~2=4.242,P=0.039)、是否淋巴转移(χ~2=14.621,P<0.001)、CEA水平(χ~2=12.503,P<0.001)有关,与年龄、性别无明显统计学相关性。通过Kaplan-Meier生存曲线分析发现,C3G蛋白高表达和低表达患者术后5年生存率分别为32.43%(12/37)、60.0%(15/25),两者比较差异具有统计学意义(χ~2=4.612,P<0.05)。3、结直肠癌细胞和正常结肠粘膜细胞中C3G的差异性表达通过Western Blot法和RT-PCR检测结直肠癌细胞HCT-116、HCT-8和结肠粘膜细胞FHC中C3G的表达情况发现,C3G蛋白表达量分别为1.043±0.116、0.899±0.149、0.551±0.155,HCT-116和HCT-8中C3G蛋白表达量与FHC相比差异均有统计学意义(P<0.05)。HCT-116、HCT-8中C3G mRNA相对表达量分别为3.582±0.561、2.645±0.612,与FHC相比差异具有统计学意义(P<0.05)。提示结直肠癌细胞中C3G表达高于正常结肠粘膜细胞。4、C3Gi结直肠癌细胞株构建使用si-C3G-1、si-C3G-2、si-C3G-3、si-C3G-NC、si-C3G-PC序列转染C3G含量较高的HCT-116细胞后,经RT-PCR检测C3G mRNA相对表达量分别为:0.296±0.064、0.305±0.986、0.465±0.146、0.411±0.109,各组与NC组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。选定干扰效率较高的si-C3G-1序列转染HCT-8、HCT-116细胞株后进行荧光转染效率检测。使用Western Blot法检测转染后蛋白表达情况,结果提示HCT-116和si-HCT-116细胞株中C3G蛋白表达量分别为0.967±0.145和0.278±0.168(P<0.05),HCT-8和si-HCT-8细胞株中C3G蛋白表达量分别为0.704±0.230和0.196±0.033(P<0.05),检测结果表明结直肠癌细胞株中C3G被成功干扰。5、沉默C3G后抑制结直肠癌细胞增殖和迁移能力si-RNA转染结直肠癌细胞后,通过CCK-8和Transwell分别检测细胞增殖数目和运动能力发现,结直肠癌细胞株HCT-8和HCT-116增殖和迁移能力均受抑制。结论:1、C3G定位于胞质和胞膜,在结直肠癌细胞和组织中表达均高于正常细胞和组织。2、肿瘤中上调的C3G可能与结直肠癌的发生发展有关,是结直肠癌患者不良预后的危险因素之一。3、沉默结直肠癌中C3G后能够抑制细胞的增殖和迁移能力,本次实验成功构建的结直肠癌C3Gi细胞系为后续探究相关分子机制奠定了基础。