论文部分内容阅读
血栓栓塞是多种心血管疾病的主要发病原因之一。目前，已有多种溶栓制剂如组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）、链激酶（SK）、尿激酶（UK）及其突变体等被用于治疗血栓性疾病，它们能有效降低病人的致死率和致残率。但是，目前的溶栓剂仍存在着再通不完全、初始再灌注延迟、血栓再形成、出血和过敏反应等缺陷。葡激酶（Staphylokinase，Sak）具有与组织型纤溶酶原激活剂相当的溶栓活性，并有更高的纤维蛋白专一性，能以大肠杆菌为宿主通过基因工程菌大量制备，是一种很有应用前景的溶栓剂。现有主要溶栓剂t-PA、SK、UK、APSAC等均是静脉注射用药，不便于多次用药，以及血栓性疾病的防治，临床迫切需要预防血栓病的新药。r-Sak分子量小，纤溶活性高，对富含血小板的陈旧性血栓的溶化效果明显强于其他溶栓药。纤溶酶原（Plg）的激活过程在纤溶系统里是一个非常关键的反应，它导致血栓的溶解，促进细胞迁移和组织重塑。最近，对uPlg和Sak以及Sk的复合物的结构解析为阐明细菌来源的纤溶酶原激活剂的作用机制扫清了障碍。研究发现Sak和Sk作为辅因子与Plg的特定表位结合后，加强了后者与底物结合的能力，并且同时改变了Plm的底物特异性以及抑制物特异性。近年来，基于结构的合理设计与基于功能的筛选进行生物大分子模拟肽研究倍受重视，并已取得令人鼓舞的成果。如美国加州Affymax研究所Dower WJ领导的小组应用随机肽库亲和筛选的方法，成功地将EPO（分子量34kD，166a．a．）缩小为20个残基的环肽，仍具有EPO的活性。比利时Collen D小组应用随机肽库研究了Sak突变体与Plg之间的相互作用，但国际上迄今未见从模拟肽水平研究两者作用的报道。另一方面，许多蛋白酶由于参予生物体内多种生理、病理过程，成为疾病研究和治疗的靶点，结合噬菌体随机肽库，可以找到与某一特定蛋白酶相作用的多肽类配体，进而研究其作用机制，为新药的开发提供先导化合物或直接作为抑制剂进入临床前研究。葡激酶（Staphylokinase，Sak）为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）溶原性噬菌体合成的一种蛋白质，与纤溶酶原（Plasminogen，Pig）形成1：1的复合物Sak-Plg后，受血块表面痕量纤溶酶（Plm）催化，形成Sak-Plm，导致其中Plm的底物特异性改变，成为高效的纤溶酶原激活剂，激活另一分子Plg形成纤溶酶，催化纤维蛋白水解，使血栓溶解，血管再通。由于Sak本身并不是酶，它与Plg结合后改变Plm的底物特异性而发挥作用，同时，我们在实验中发现大肠杆菌表达的Sak形成包涵体，经强变性剂如6M盐酸胍或8M尿素溶解后，仍然有纤溶活性，这表明：Sak是一种辅因子（cofactor），在发挥纤溶活性时对结构的要求并不严格，很可能只需要Sak分子中维持一定构象的肽段或模拟肽，即可发挥Sak的功能；因此，我们以微小纤溶酶原（micro-Plasminogen，uPlg）为靶分子，应用随机肽库进行Sak模拟肽的筛选，再利用计算机辅助分子设计和结构与功能信息处理，可望获得模拟Sak功能的多肽类溶栓剂，不但可用于血栓病的急救与预防，而且可能进一步发展为模拟肽和化学合成类的小分子溶栓防栓药物。利用丝状噬菌体表面展示的随机肽库筛选与uPlg有高亲和力的多肽，我们得到了“CSPDASRLC”和“ANQHHKHHHPHF”两个序列，它们分别来源于由二硫键限制构象的7肽库和没有构象限制的12肽库。对这两个序列进行合成后分别测定其水解纤维蛋白的活性发现，二者仅显示有微弱的活性，且前者的活性高于后者。在此基础上，对序列“CSPDASRLC”进行结构改造，将该序列融合表达于水蛭素的32-36位Loop区，由于野生型水蛭素的Loop32-36展在水蛭素与凝血酶的作用面之外，是一个非常典型的β—Tum结构，这使得该插入序列具有较好的溶液可及性，增加了该模拟肽的溶解性，进一步限制了分子自由度，提高了其构象稳定性，并且该序列的插入不影响水蛭素本身抑制凝血酶的活性。成为一类Ⅲ型模拟肽分子。通过毕赤酵母表达系统，实现了该模拟肽的生物表达，纯化后分别利用发色底物法和凝胶牛奶板溶圈法检测其水解纤维蛋白的活性，发现新的模拟肽分子具有较为明显的溶栓活性，相比原来的从随机肽库直接筛选得到的多肽分子，新的Sak模拟肽的活性提高了约100-200倍；并且由于结构稳定，大大提高了其生物利用度，可望在其基础上通过结构改造进一步提高其活性。水蛭素（Hirudin）是从水蛭中提取的一种抗凝血蛋白质。1955年，Markwardt指出这种抗凝血物质为蛋白质，定名为水蛭素；1986年后基因重组水蛭素研究工作蓬勃开展，先后有瑞士Ciba-Geigy、德国Hoechst、法国Transgene公司的重组水蛭素问世。水蛭素含有65-66个氨基酸残基，为单链蛋白结构，分子内含3对二硫键。根据其N-端氨基酸及结构差异可分为HV1、HV2、HV3等突变体类型。水蛭素与凝血酶结合比例为1：1，水蛭素分子有超过40％的结构与凝血酶紧密结合，结合区域覆盖了凝血酶分子中纤维蛋白原识别区及切割区（活性区），水蛭素N端致密区抑制凝血酶活性区，C端疏松区抑制凝血酶识别区，其凝血酶抑制常数达10-11-10-14，抗凝活力极强。目前，国内尚无此类产品，在国外已上市的有Hoechst公司的重组水蛭素产品（lepirudin，商品名Refludon，1997年德国HMR公司的重组水蛭素Refludan（?）（Lcpirudin）在欧洲获准上市，98年5月获得美国FDA批准），用于治疗对肝素过敏的患有肝素诱导血小板减少病症（heparin-induced thrombocytopenia，HIT）的病人的抗血栓治疗。另外，瑞士Novartis公司的重组水蛭素产品Desirudin在用于全髋置换术患者预防血栓栓塞并发症方面也有了确切的疗效。临床上，重组水蛭素多用于治疗不稳定性心绞痛（USA）、急性心肌梗死（AMI）、血管成形术、术后血栓形成、血液透析、体外循环、弥散性血管内凝血（DIC）等。水蛭素及其突变体已经在临床得到应用，临床实验表明水蛭素不引起过敏、免疫反应，并且不会造成循环功能障碍。由于水蛭素本身就是一种抗凝药物，融合于水蛭素Loop32-36的Sak模拟肽因为不影响水蛭素与凝血酶的作用而兼有抗凝和溶栓两种功能，可同时从两种途径抑制体内血栓的形成；此外，由于临床实验表明水蛭素不引起过敏、免疫反应，该Sak模拟肽可望解决困扰Sak进入临床用药的免疫原性过高、易引发过敏反应的问题。该Sak模拟肽分子量约为野生型Sak的一半，可以通过毕赤酵母大量表达并纯化；其分子结构与Sak和Sk完全不同，证明了通过模拟Sak或Sk等细菌来源的纤溶酶原激活剂分子与Plg分子所形成的复合物特定部位的拓扑结构，可以开发出新型的纤溶酶原激活剂作为新一代的溶栓和防栓药物。