随着感染性疾病的控制，视网膜变性性疾病已成为主要致盲眼病之一。这类变性性疾病主要受损的是光感受器细胞，而光感受器细胞被认为是受损后不能再生的神经细胞，故目前尚无理想的治疗方法。 对中草药的研究显示，某些中草药的有效成份如银杏内酯等具有神经元保护和抗细胞凋亡两方面作用；视网膜是大脑的延伸，光感受器细胞也是终末分裂的神经细胞，有着复杂的神经活动。因此视网膜变性性疾病治疗可借鉴神经系统变性疾病的治疗，但也有其特殊性。故我们应用银杏内酯进行防治视网膜变性的实验研究，探讨其药理机制，希望能对视网膜变性疾病提供一种新的、有效的治疗途径。本研究共分四部分： 第一部分银杏内酯B对体外培养的大鼠视网膜神经细胞凋亡的影响目的：采用体外培养的大鼠视网膜神经细胞的谷氨酸损伤模型，观察银杏内酯B对体外培养的大鼠视网膜神经细胞凋亡的作用及可能的作用机制。 方法：采用体外原代培养的大鼠视网膜神经细胞，建立谷氨酸损伤的视网膜神经细胞凋亡模型，与不同浓度的银杏内酯B(GinkgolideB，GB)共同培养，用噻唑蓝(MTT)法测定神经细胞存活率；流式细胞仪观察神经细胞凋亡及其相关基因Bcl-2和Bax蛋白表达。并应用激光共聚焦显微镜(Confocal)进行线粒体膜电位(MMP)测定。 结果：谷氨酸(8mmol/L)作用后，视网膜神经细胞存活率降低，bcl-2表达降低，Bax表达增强，细胞凋亡加重，MMP下降。GB(10～100μmol/L)能剂量依赖性抑制谷氨酸(8mmol/L)引起的细胞存活率下降。GB干预后，bcl-2表达增强，Bax表达降低，MMP显著升高，细胞凋亡明显减少。 结论：GB能剂量依赖性对抗谷氨酸兴奋性毒性，保护视网膜神经细胞，这一作用可能是通过提升bcl-2表达、降低Bax表达和升高视网膜神经细胞MMP来实现的。 第二部分MNU诱导的视网膜变性大鼠模型及其凋亡机制的研究目的：探讨N-甲基-N-亚硝脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)对大鼠视网膜光感受器细胞毒性作用及其作用机制。 方法：生后50天的SD大鼠84只，随机抽取4只为正常对照组，余下80只分为4大组，每组20只，分别按体重一次性腹腔注射MNU80mg/kg、60mg/kg、40mg/kg和30mg/kg。各组每次4只分别于12h、24h、48、3d、5d行右眼闪光ERG检查，并于造模后24h、48h、3d、5d、7d处死动物，取眼球做病理切片。并通过视网膜形态学分析测量中心视网膜的外视网膜厚度(外核层和光感受器细胞层)；TUNEL试剂盒和透射电镜检测光感受器细胞凋亡；免疫组织化学方法检测MNU作用不同时间大鼠视网膜中Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达。 结果：1.ERG观察：正常对照组的大鼠ERG波形清晰，a、b波振幅高。MNU80mg/kg、60mg/kg、40mg/kg和30mg/kg剂量组a波消失时间分别为3h、12h、24h、5d；b波消失时间分别为12h、24h、3d、7d。 2.形态学检查：正常组大鼠中心视网膜的外视网膜厚度为98.4±1.8μm。ⅣMNU处理后5和7d，80mg/kg、60mg/kg、40mg/kg和30mg/kg剂量组外视网膜厚度分别为0μm、9.5±2.3μm、42.8±2.7μm、71.3±2.4μm和0μm、0μm、20.8±2.5μm、62.9±2.0μm，其损伤程度和剂量及时间成正比。 3.透射电镜观察：MNU40mg/kg组的大鼠视网膜在24h后，光感受器细胞开始变小，核染色质浓缩；随给药剂量的增加，MNU60mg/kg和MNU80mg/kg的大鼠视网膜在24h后，光感受器细胞变小，核染色质浓缩的现象更加明显。 4.TUNEL检测：正常对照组未见TUNEL标记的阳性细胞。MNU作用1d，视网膜外核层检测到阳性凋亡细胞核，2d时明显增加，达高峰；随后逐渐减少，5d时见少量阳性细胞核，7d未见TUNEL标记的阳性细胞。 5.免疫组织化学：正常对照组视网膜各层均未见Bcl-2、Bax和Caspase-3阳性表达。MNU处理24h后，视网膜外核层可见Bax和Caspase-3阳性表达，2d时表达最强，此后逐渐表达减弱，5d时仍有少量阳性表达。MNU处理组各时间点均未见视网膜Bcl-2阳性表达。 结论：1.MNU可选择性地诱导视网膜光感受器细胞发生凋亡，该作用呈剂量和时间依赖性。 2.MNU诱导视网膜光感受器细胞发生凋亡的机制可能与上调Bax和Caspase-3表达有关。 第三部分银杏内酯B对MNU诱导的大鼠视网膜变性的保护作用目的：观察不同剂量的银杏内酯B对MNU诱导的SD大鼠视网膜变性的保护作用。 方法：取生后46天的SD大鼠86只，随机抽取6只为A组：正常对照组；余下80只分为4大组，每组20只，随机分为B组：模型对照组(腹腔注射MNU40mg/kg)，C组：银杏内酯B大剂量组(腹腔注射GB60mg/kg)，D：银杏内酯B中剂量组(腹腔注射GB40mg/kg)，E：银杏内酯B小剂量组(腹腔注射GB20mg/kg)。银杏内酯B治疗组于生后46天开始腹腔给药，每日1次，连续给药7日；模型对照组给等量生理盐水灌胃。第50天模型对照组及银杏内酯B治疗组均一次性腹腔注射MNU40mg/kg，建立大鼠视网膜变性模型。各组每次4只分别于24h、48h、3d、5d、7d行右眼闪光ERG检查，并通过视网膜形态学分析测量中心视网膜的外视网膜厚度。 结果：1.视网膜功能学检查：A组ERGa波振幅为105.4±16.8μV，a波潜伏期为22.8±1.3ms；b波振幅为292.6±19.6μV，b波潜伏期为38.8±3.7ms。B组24h后，a波消失，72hERG呈熄灭型。C组2d后，a波消失，b波振幅下降为正常的32％；3d时，其中2只大鼠ERG呈熄灭型，另2只b波振幅下降为正常的8％；5dERG呈熄灭型。D组3d后，a波消失，b波振幅下降为正常的22％；5d时，其中1只大鼠ERG呈熄灭型，另3只b波振幅下降为正常的14％；7dERG呈熄灭型。E组3d后，a波消失，b波振幅下降为正常的20％；5d时，b波振幅下降为正常的14％；7d时b波振幅下降为正常的8％。 2.形态学检查：正常组大鼠中心视网膜的外视网膜厚度为98.4±1.8μm。MNU处理7天B组外视网膜厚度为17.8±2.1μm，而C、D、E组分别为25.2±2.7μm、38.3士2.3μm、45.8±2.3μm。GB各剂量治疗组与模型对照组外视网膜厚度比较均可见显著性差异(P＜0.01)。且C、D、E三组间比较具有显著性差异(P＜0.01)，可见GB治疗组给药剂量在20～60mg/kg间，呈剂量依赖性。 结论：银杏内酯B对MNU诱导的实验性大鼠视网膜变性所致的大鼠视网膜光感受器细胞损伤和视功能损害具有保护作用，并且这种作用呈剂量依赖性。 第四部分银杏内酯B对MNU诱导的大鼠视网膜变性的保护作用机制的研究目的：探讨银杏内酯B对MNU诱导的大鼠视网膜变性的保护作用机制。方法：生后46天的SD大鼠26只，随机分为A：正常对照组；B：模型对照组；C：GB治疗组。A组6只，其余两组各10只。GB治疗组于生后46天GB40mg/kg灌胃给药，模型对照组给等量生理盐水灌胃，并于生后第50天将2组分别按体重一次性腹腔注射MNU40mg/kg，建立大鼠视网膜变性模型。各组每次2只分别于腹腔注射MNU后24h、48h、3d、5d、7d处死动物，取1只大鼠眼球做病理切片，TUNEL试剂盒检测光感受器细胞凋亡；免疫组织化学方法检测MNU作用不同时间大鼠视网膜中Bcl-2和Bax的表达。另1只分离出视网膜提取RNA，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Bcl-2和BaxmRNA的表达。 结果：1.TUNEL检测：正常对照组大鼠视网膜内未见凋亡细胞核。模型对照组MNU作用1d，视网膜外核层出现TUNEL阳性细胞核，2d时大量增多，达高峰，随后逐渐减少，5d时仍见少量TUNEL阳性细胞核。GB40mg/kg治疗组与模型组比较外核层细胞凋亡指数有显著性差异(P＜0.01)GB40mg/kg治疗组在MNU造模后5d时未见TUNEL阳性细胞核。 2.RT-PCR：Bcl-2/Bax比值显示：MNU作用后12h、1d、2d、3d和5d，模型对照组二者比值分别为0.36、0.15、0.29、0.42和0.64。GB治疗组二者比值分别为0.98、0.92、0.53、0.45、0.68，高于模型组。 3.免疫组织化学：正常对照组视网膜各层均未见Bcl-2和Bax阳性表达。模型对照组MNU给药后各时间点均未见视网膜Bcl-2阳性表达。MNU给药后1d，视网膜外核层可见Bax阳性表达，2d时最强，此后表达逐渐减弱，5d时仍有少量阳性表达。GB治疗组Bcl-2在MNU给药后1d表达最强，2d阳性表达下降，3d后阳性表达消失。Bax在MNU给药后2d表达最强，3d阳性表达下降，5d后仍有阳性表达。 结论：1.银杏内酯B能抑制视网膜光感受器细胞发生凋亡。 2.银杏内酯B抑制视网膜光感受器细胞发生凋亡的机制可能与上调Bcl-2的表达量，提高Bcl-2/Bax比值有关。