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背景肿瘤转移过程中,肿瘤细胞会从原发部位扩散并定植到远端器官,这一过程是造成癌症患者死亡的主要原因。在黑色素瘤,乳腺癌,肺癌等多种肿瘤中,病程早期即可出现前哨淋巴结转移。研究表明肿瘤细胞能够从前哨淋巴结转移到远端组织,前哨淋巴结转移的情况对评估病人预后有重要意义。肿瘤淋巴管是肿瘤细胞从原发部位转移到前哨淋巴结的重要通道。越来越多的证据表明,在包括黑色素瘤在内的多种肿瘤中,高密度的肿瘤内淋巴管与较高的淋巴结转移率以及较短的无疾病生存期密切相关。此外,肿瘤进展过程中往往伴随着肿瘤组织中的淋巴管生成,大量的临床数据分析和动物实验研究都表明肿瘤淋巴管生成对于肿瘤发生淋巴结转移起着积极作用。淋巴管生成依赖于淋巴管内皮细胞增殖,出芽,迁移等多个生物学过程的精细配合。出芽作为淋巴管生成的关键步骤,受到细胞内代谢水平的调控。然而,在肿瘤淋巴管生成过程中调控淋巴管出芽的机制并不十分清楚。S100A4蛋白属于钙结合蛋白,在胞内和胞外发挥多种生物学功能。它不仅能够调节肿瘤细胞包括增殖、侵袭在内的生理活动,同时也参与肿瘤微环境中肿瘤血管生成、调控免疫反应以及多种细胞因子和生长因子的分泌等过程。近期的研究发现,S100A4在代谢水平上促进巨噬细胞的促肿瘤表型,这提示S100A4能够参与调控细胞的代谢。此外,临床数据分析表明肿瘤组织中S100A4的表达水平与乳腺癌、结直肠癌、下咽癌等多种肿瘤的淋巴结转移存在显著的相关性。然而,S100A4对于肿瘤淋巴管生成和淋巴转移的关系,以及其调控的分子机制并不清楚。因此,在本文中我们探讨了S100A4蛋白对肿瘤淋巴管生成和淋巴转移的影响及调控的分子机制。目的本课题旨在探究S100A4对黑色素瘤淋巴转移以及淋巴管生成的影响,揭示其代谢水平上调控的分子机制方法1.使用S100A4全身敲除小鼠(S100A4-/-)与野生型（WT）小鼠,构建黑色素瘤淋巴结转移模型。观察记录小鼠肿瘤生长情况。在25天时处死小鼠,收集小鼠膝后窝淋巴结进行小动物活体成像拍照,观察肿瘤淋巴转移情况。剥取肿瘤组织后运用OCT包埋,进行免疫荧光染色。观察肿瘤内LYVE1+或PROX1+淋巴管数量变化情况。2.运用免疫组化技术检测肿瘤组织中淋巴管内皮细胞上S100A4蛋白的表达情况,并于淋巴管进行共定位。3.使用淋巴管内皮细胞S100A4特异敲除(S100A4ΔLYVE1)及其对应的对照小鼠,构建黑色素瘤淋巴结转移模型。观察记录小鼠肿瘤生长情况。在25天时处死小鼠,取小鼠膝后窝淋巴结进行小动物活体成像拍照,观察肿瘤淋巴转移情况。同时剥取肿瘤组织进行OCT包埋,冰冻切片后进行免疫荧光染色。观察肿瘤内LYVE1+或PROX1+淋巴管数量变化情况。4.运用Crisper-cas9系统构建S100A4蛋白稳定敲除的SVEC4-10细胞,运用siRNA转染技术构建S100A4瞬时敲低的原代人淋巴管内皮细胞。首先,利用成管实验体外验证S100A4对淋巴管生成的影响。运用3D细胞球出芽实验对细胞的出芽功能进行检测。同时分别运用CCK8增殖实验,transwell及划痕检测细胞的增殖,迁移功能。5.使用转录组学测序技术分析S100A4缺失后对SVEC4-10细胞中基因表达水平的影响。6.检测对照组和S100A4敲除组细胞的糖酵解速率,胞内ATP含量,并运用western blot技术检测S100A4蛋白缺失后对淋巴管内皮细胞AMPK信号通路激活的影响及糖酵解相关酶的蛋白水平变化情况。7.观察6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3（PFKFB3）抑制剂3PO及AMPK信号通路抑制剂Compound C对SVEC4-10细胞出芽及迁移功能的影响。8.构建黑色素瘤淋巴结转移瘤模型后,在小鼠腹腔注射糖酵解关键酶PFKFB3的抑制剂3PO来观察抑制PFKFB3后对肿瘤组织内淋巴管生成的影响。9.使用RT-PCR和western blot技术检测低氧环境对于淋巴管内皮细胞中S100A4表达情况的影响。结果1.S100A4-/-与WT组相比发生更少的膝后窝淋巴结转移。且与对照组相比,S100A4-/-小鼠肿瘤组织中LYVE1+或PROX1+的淋巴管数量明显减少。2.检测发现B16F10黑色素瘤肿瘤组织内的淋巴管内皮细胞表达S100A4蛋白。3.S100A4ΔLYVE1小鼠与对照组相比发生更少的膝后窝淋巴结转移。且与对照组相比,S100A4ΔLYVE1小鼠肿瘤组织中LYVE1+或PROX1+的淋巴管数量减少。4.体外实验结果显示,淋巴管内皮细胞缺失S100A4后,其成管能力受到抑制。利用3D球出芽实验发现,S100A4促进淋巴管出芽的过程。进一步的研究显示S100A4增强淋巴管内皮细胞的迁移能力。而S100A4蛋白的缺失并不影响淋巴管内皮细胞的增殖能力。5.RNA-Sequence的测序结果显示,SVEC4-10细胞中S100A4缺失引起的差异表达基因在糖酵解过程及AMPK信号通路中得到显著富集。体外验证发现敲除S100A4的淋巴管内皮细胞糖酵解水平降低,AMPK信号通路激活受到抑制。同时,SVEC4-10缺失S100A4后糖酵解关键酶PFKFB3的蛋白表达水平降低。6.体外加入PFKFB3的抑制剂3PO或AMPK信号通路的抑制剂Compound C后,细胞的出芽,迁移水平受到抑制。而这一现象在S100A4缺失的细胞中并不明显。在体内动物实验中,与对照组相比在给予小鼠3PO治疗后可以显著抑制肿瘤组织中淋巴管数量。7.低氧环境能够上调淋巴管内皮细胞中S100A4的表达。结论本课题研究表明,S100A4蛋白通过正向调控淋巴管内皮细胞的糖酵解促进淋巴管内皮细胞出芽,进而促使黑色素瘤组织中淋巴管生成以及肿瘤淋巴结转移。以上结果提示,S100A4是一种新的肿瘤淋巴管生成调控因子,靶向淋巴管内皮细胞中S100A4可能成为一种潜在的抑制肿瘤淋巴转移的治疗策略。