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第一部分背景：从生物可降解的材料中持续释放质粒DNA(plasmid DNA, pDNA)能延长外源基因的表达时间和提高其表达水平。葡聚糖-聚己内酯—甲基丙烯酸羟乙酯共聚N-异丙基丙烯酰胺(Dextran-poly(e-caprolactone)-hydroxylethyl methacrylate/poly(N-isopropylacrylamide), Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm)水凝胶是一种人工合成的生物可降解的温度敏感性生物材料。研究已证实通过从这种水凝胶中持续释放pDNA复合物能延长外源基因在细胞内表达的时间并增强其表达水平,然而,在这个研究中,水凝胶与pDNA的混合物悬浮在细胞培养基中,与细胞没有直接接触。研究表明细胞和水凝胶之间的相互作用对基因转染很重要,但是目前不清楚如果将细胞培养在成胶后的Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm水凝胶与pDNA混合物表面是否能增强外源基因在细胞内的表达效果。目的：本实验的目的是研究将H9C2心肌细胞培养在成胶后的Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm水凝胶与pDNA混合物表面是否能延长外源基因在细胞内的表达时间和增强基因的表达水平以及这种水凝胶的浓度是否对外源基因的传递和表达存在影响。方法：不同浓度Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm水凝胶(1.0wt%,1.5wt%和3.0wt%)溶液成胶后冻干后,用扫描电子显微镜观察其表面和横截面的形态特征。计算pDNA在不同浓度的水凝胶的累积释放率。H9C2心肌细胞培养在不同浓度成胶后的Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm水凝胶与pDNA混合物表面,在细胞培养箱中培养,48h后通过CCK-8法测定测定细胞存活率,7d和14d后使用流式细胞仪测定转染率。结果：不同浓度Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm水凝胶(1.0wt%,1.5wt%和3.0wt%)的孔径均在5μm以下,1.5wt%的水凝胶孔径比1.0wt%的水凝胶小,比3.0wt%的水凝胶大(P<0.05)。在5d后,1.5wt%的水凝胶pDNA累积释放率比1.0wt%的水凝胶低,比3.0wt%的水凝胶高(P<0.05)。与一般的转染方法相比,生长在成胶后pDNA与这些水凝胶混合物表面上的H9C2心肌细胞存活率较高(P<0.05)。在转染7d和14d后生长在质粒与1.5wt%水凝胶混合物表面上的H9C2心肌细胞转染效率最高(P<0.05)。结论：随着Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm水凝胶浓度的升高,其孔径变小,而其包裹的质粒在体外的累积释放率也随之降低。将细胞培养在成胶后的水凝胶与pDNA混合物表面能延长外源基因在H9C2心肌细胞内的表达时间和增加基因的表达水平。水凝胶的形态和DNA释放率对细胞的转染率均有影响,选择恰当的水凝胶浓度能提高转染率。第二部分背景：恢复冠状动脉血流能改善心肌梗死后的心室重构和心功能不全,但是再灌注治疗也会引起心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion I/R)损伤。血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)能通过降低血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, AngⅡ)的水平来抑制I/R诱导的心肌细胞凋亡。然而,在长期使用ACEI后,血浆和心脏内的血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)水平会反馈性的升高。能表达靶基因短发夹RNA(short-hairpin RNA, shRNA)的质粒在细胞内可生成小干扰RNA,从而沉默相应基因,为了防止这种ACE反馈性的升高,通过RNA干扰(RNA interference RNAi)沉默ACE基因表达可能是一种较好的方法。此外,体内的研究很难区别抑制细胞内肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)和全身RAS在降低I/R损伤中作用,而体外研究很容易评估抑制细胞内RAS在减轻I/R损伤中作用。目的：本实验的目的是研究通过RNAi技术沉默H9C2心肌细胞内的ACE基因是否能改善缺氧／复氧(anoxia/reoxygenation, A/R)诱导的细胞凋亡。方法：H9C2心肌细胞随机分为以下4组：(1)正常对照组(Con):H9C2心肌细胞按正常方式培养,且不经任何因素处理；(2)A/R组：H9C2心肌细胞仅经受缺氧3h再复氧2h,不经其它因素处理；(3)阴性对照组(negative control, NC组)：H9C2心肌细胞转染阴性对照ACE-shRNA质粒48h后经受缺氧3h再复氧2h;(4)shRNA组：H9C2心肌细胞转染ACE-shRNA质粒48h后经受缺氧3h再复氧2h。缺氧前和复氧结束后通过CCK-8法测定心肌细胞的存活率,复氧结束后心肌细胞再培养24h,然后分别采用双标的流式细胞术和比色法测定H9C2心肌细胞的凋亡及caspase-3活性,Real-time RT-PCR和Western-blot检测ACE表达,Western-blot检测ACE2、Bcl-2及Bax蛋白表达。酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定H9C2心肌细胞培养液中AngⅡ的浓度。结果：在ACE-shRNA质粒转染H9C2心肌细胞48h后,76.8%±5.1%的细胞显示绿色荧光。各组细胞的存活率在A/R之前没有明显区别,在A/R之后,与正常对照组相比,A/R组的H9C2心肌细胞的存活率明显降低、细胞内ACE和ACE2表达明显增加、细胞培养液中AngⅡ水平明显升高、细胞凋亡明显增加、Caspase-3活性明显升高和心肌细胞Bcl-2和Bax蛋白水平及Bax/Bc1-2比值明显增加(P<0.05)。与MR组相比,shRNA组H9C2心肌细胞的存活率明显升高、细胞内ACE表达降低、细胞培养液中AngⅡ水平明显降低、细胞凋亡明显减少、Caspase-3活性明显下降、Bax蛋白水平及Bax/Bcl-2比值明显降低、心肌细胞ACE2蛋白和Bcl-2蛋白水平进一步升高(P<0.05)。A/R组与NC组之间的H9C2心肌细胞内上述指标无明显差异(P>0.05)。结论：心肌细胞内ACE基因沉默能调节细胞内的RAS,进而调节细胞内凋亡途径,保护A/R诱导的心肌细胞损伤。第三部分背景：非病毒性的基因载体比病毒性的基因载体安全,构建成本低,但是其转染效率低,外源基因表达持续时间短,从而限制了其在临床中的应用。从生物材料里持续的释放pDNA是延长外源基因表达时间和增强表达效果的一种可行的方法。体外的试验已证实,通过Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm水凝胶控制释放其包裹的pDNA复合物能延长和增强外源基因的表达,并且这种水凝胶注射到心肌梗死后的兔心脏能抑制心肌梗死后心室重构。目的：本实验的目的是研究ACE-shRNA质粒负载的Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm水凝胶注射到大鼠心脏后是否能延长外源基因表达时间和增强基因表达效果。此外,在大鼠心肌梗死后,在心肌内直接注射ACE-shRNA质粒负载的Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm水凝胶是否能降低心脏内ACE的表达并比单独注射ACE-shRNA质粒或水凝胶获得更好的心脏保护作用。方法：心肌梗死大鼠随机为以下四组：磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)组：100μL磷酸盐缓冲液；pDNA组：100μL含有10μg的ACE-shRNA质粒的PBS溶液；NC组：100μL含有10μg阴性对照ACE.shRNA质粒的水凝胶；pDNA+Gel组：100μL含有10μACE-sHrnA质粒的水凝胶。心肌梗死后接受多点心肌内注射,心肌梗死30d后心脏超声测量左室收缩末期内径(left ventricular end systolic dimension,LVESD)、左室舒张末期内径(left ventricular end diastolic dirnension, LVEDD)、射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)等指标；通过右颈动脉导管测量左室等容收缩/舒张期压力上升或下降最大速率(±dp/dtmax)；用Masson’s三色法染色后通过数字图像处理系统计算心梗面积(%),冰冻切片在荧光显微镜下观察增强绿色荧光蛋白表达,TUNEL检测心肌细胞凋亡,免疫组织化学法测定血管密度、Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量；Real-time RT-PCR和Western-blot检测ACE表达,用ELISA测定心肌内Ang II的浓度。结果：心肌梗死2d后,基线超声心动图显示四组之间LVEDD,LVESD和LVFS殳有显着性差异(P>0.05)。心肌梗死后30d后,在pDNA+Gel组的心脏中可见增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP),在pDNA组没有发现EGFP。,与PBS相比,NC组的LVEDD和LVESD显著减少.FS和+dp/dtmax显著增加、心肌梗死面积及细胞凋亡显著减少、Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量明显减少和ACE表达明显降低(P<0.05)。而水凝胶和ACE-shRNA联合治疗进一步加强了这种心脏保护作用(P<0.05),各组间血管密度无明显差异(P>0.05)；PBS组合pDNA组之间上述指标无明显差异(P>0.05)。结论:ACE-shRNA质粒负载的Dex-PCL-HEMA/PIPAAm水凝胶注射到大鼠心脏后能延长外源基因表达时间和增强基因表达效果。此外,在大鼠心肌梗死后,在心肌内直接注射ACE-shRNA质粒负载的Dexr-PCL-HEMA/PNIPAAm水凝胶能降低心脏内ACE的表达,并能比单独注射ACE-shRNA质粒或水凝胶取得更好的心脏保护作用。