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背景和目的:粘膜相关淋巴组织(mucosa-associated lymphoid tissue,MALT)淋巴瘤,简称MALT淋巴瘤。是来源于边缘带B细胞(marginal zone B细胞,MZB细胞)的结外低度恶性淋巴瘤,约占非霍奇金淋巴瘤的8%,是最常见的胃肠道淋巴瘤。这类肿瘤可由慢性细菌感染或者慢性炎症引起,也可由染色体易位导致的基因异常表达引起。前者可以用抗菌和抗炎治疗,但后者对上述治疗无效,为难治性肿瘤。这类肿瘤目前已知的染色体异常主要为t(1;14)引起BCL10高表达,t(11;18)形成IAP2-MALT1融合基因,以及t(14;18)易位导致MALT1高表达,这三种情况均有BCL10的异常高表达。而在正常情况下,BCL10仅在边缘带B细胞胞质内呈弱表达。诸多研究表明BCL10异常高表达与MALT淋巴瘤高恶性度与难治性密切相关。
因此为研究BCL-10高表达导致MALT淋巴瘤的发病机制,我们构建了Eμ-BCL10转基因小鼠模型。前期的报道中发现,MALT淋巴瘤的前体细胞-MZB细胞在所有转基因小鼠脾脏中增生,且NF-KB通路被激活。本课题组前期的研究发现这些增生的MZB细胞在体外培养显示出抗凋亡特性,且MZB细胞中的Caspase3和Caspase8活性被抑制。在此基础上,本研究拟通过BCL-10转基因杂合子和纯合子小鼠研究BCL-10蛋白量与边缘带B细胞增生和抗凋亡的量效关系,以期揭示BCL-10蛋白高表达对该肿瘤发病的直接关系,同时研究其抗凋亡的分子机制。
方法:PCR鉴定Eμ-BCL10转基因小鼠;Western Blot检测BCL10转基因蛋白表达水平;应用anti-CD43磁珠抗体和anti-CD23-PE+anti-PE磁珠抗体双阴性分选脾脏未受刺激的边缘带B细胞(marginalzoneB细胞,MZB细胞)用于体外增殖和凋亡实验,运用鼠尾静脉注射Anti-IgM(80μg/只)研究增生的边缘带B细胞在体内的抗凋亡;免疫共沉淀分析BCL10、caspase8和API2蛋白的相互作用;WesternBlot方法检测caspase8和API2的蛋白表达水平。
结果:用WesternBlot实验方法定量BCL-10蛋白在野生型FVB小鼠,Eμ-BCL10转基因杂合子及纯合子小鼠中的表达量,它们的比值为:FVB:FVB:Tg/+:Tg/Tg=1:2:3。通过流式实验证明MALT淋巴瘤前体细胞-MZB细胞在上述三种小鼠脾脏B细胞中的比例分别约为30%,50%和70%。细胞增殖实验结果显示anti-IgM刺激时,转基因小鼠的MZB细胞比FVB野生型小鼠增殖高2～5倍,但在LPS或PMA+Ionomycin刺激时,两者差异无统计学意义。鼠尾静脉注射Anti-IgM体内诱导边缘带B细胞的凋亡,结果显示anti-IgM能在体内诱导转基因阴性鼠。
(FVB)中边缘带B细胞的凋亡(凋亡细胞为15%),但不能诱导转基因小鼠(Tg/+和Tg/Tg鼠)中该细胞的凋亡。通过鼠尾静脉注射Anti-IgM体内诱导边缘带B细胞的凋亡,说明高表达的BCL10蛋白抵抗这种处理所诱导的凋亡。免疫共沉淀(co-IP)研究证明BCL10蛋白与caspase-8和IAP2蛋白共沉淀,显示BCL10可能通过与IAP-2和caspase-8相互作用从而导致边缘带B细胞抗凋亡。WesternBlot研究显示caspase-8的蛋白表达量在这3种小鼠中没有明显改变,但凋亡抑制蛋白IAP-2表达量随着BCL10蛋白的增加而增加,这种增加可能是由于BCL10高表达所导致的NF-kB的激活所引起。
结论:BCL10表达水平与MALT淋巴瘤的前体细胞-MZB细胞的增生具有正相关的量效关系,其导致增生的机制是其位于BCR受体(IgM)下游使MZB细胞在BCR受到刺激时增殖增强并且不发生凋亡。其分子机制是BCL10蛋白增高能刺激NFkB激活(我们已发表的结果-Blood,2009),导致其下游基因IAP-2高表达,高表达的BCL10再与IAP-2和caspase-8在B细胞抗原受体(BCR,IgM)下游形成蛋白复合体,导致caspase-8活性抑制(pediatric Bloodand Cancer,inpress),从而使边缘带B细胞抗凋亡进而发生MALT淋巴瘤。