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木质素过氧化物酶(LiP)对难降解污染物具备高效的降解能力,但弱稳定性和难以重复使用的缺点限制了其实际应用。酶的固定化是解决这些问题的最有效方法之一,但相关研究开展的还不多,本研究围绕合成性能优良的固定化酶载体和设计筛选适宜的固定化策略,开展了一系列研究工作。选用三嵌段共聚物P123为模板剂,以1,3,5-三异丙基苯(TIPB)为扩孔剂,在NaAC-HAC缓冲液中制备了介孔材料。系统考察了硅源、扩孔剂投加量、初始合成pH、初始合成温度等条件对介孔材料特性的影响。结果表明,当以正硅酸甲酯(TMOS)、正硅酸乙酯(TEOS)和液体水玻璃(NaSi)作硅源时,可分别获得“葡萄状”、“乒乓球状”和“麦穗状”的介孔材料。增加扩孔剂的投加量时,样品的孔径逐渐增大,但孔道有序度明显下降,宏观形貌也由规则的柱形变为不规则块状。逐渐提高初始合成pH时,样品的形貌实现了由块状物到球型颗粒的转变,孔结构由蠕虫状向二维六方状和囊泡状的转变。提高初始合成温度时,样品宏观形貌由规整的小球逐渐向粒径较大的球型颗粒和壳状物转变,且温度较低时易获得二维六方的介孔。确定的最佳介孔材料合成条件为:选用TMOS为硅源,TIPB的投加量为1.0g,初始合成pH和温度分别为3.5和12℃。选用最佳条件下合成的介孔材料对LiP进行物理吸附固定化,考察了酶的投加量和固定化时间对固定化效果的影响。确定初始酶量与载体最佳配比为76.8mg/g,最佳固定化时间为12 h。此时蛋白负载量8.87mg/g,固定化LiP表观活性为41.45U/mg。固定化LiP的pH稳定性和热稳定性都有明显提高,且具有较好的存储稳定性。重复使用6次后,固定化LiP仅可保留30%的活性。采用后嫁接法,选用γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和β-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(AEAPMDS)两种功能修饰剂分别对介孔材料进行-NH2修饰。修饰后的载体用于采用化学吸附法对LiP进行固定化。其蛋白质负载量分别为4.63mg/g和4.49mg/g,固定化LiP表观活性分别为10.22U/mg和10.55U/mg。选用戊二醛、对苯异硫氰酸酯、均三嗪和碳二亚胺四种偶联剂对LiP进行共价偶联固定化,结果发现均三嗪法的固定化效果最好,蛋白质负载量为12.15mg/g, LiP表观活性为541.9U/mg,与游离LiP相比,其具有更强的耐酸性,对温度却更敏感;且有良好的重复使用性能。对0.25mM的酸性橙,固定化LiP在200s内对其脱色率为30%;重复脱色5次后,仍能保持60%的脱色率。