目的:近年来,将较高浓度的冷冻保护剂和超快速的冷冻速率相结合的玻璃化冷冻技术成为当前的研究热点,由于冷却速度很快,以至于在低温时形成了透明的玻璃状固体,冷却过程中黏度很高却没有冰晶形成,因而极大地避免了冷冻过程中形成的冰晶对细胞脂质膜及细胞骨架结构的损伤,使器官冷冻保存更简单、快速、高效。不少学者指出,在深低温保存的过程中如能实现玻璃化,将更有利于复合组织和器官的保存,且已有学者通过比较细胞活性认为玻璃化方法优于传统的低温冷冻法,运用玻璃化冷冻的方法成功地实现低温保存哺乳动物胚胎、生殖细胞、血管以及关节软骨等。本研究拟在国内外现有的深低温冷冻保存液以及玻璃化冷冻技术的基础上,选用目前毒性最低,保存效果较好的冷冻保存液,联合玻璃化冷冻技术,尝试采用玻璃化冷冻技术对气管实施深低温保存,评价玻璃化冷冻对气管的粘膜上皮、软骨细胞及软骨间质等的影响,并与传统的程控缓慢降温方法保存的气管进行对比,同时进行玻璃化冷冻气管的原位同种异体移植实验,以评价冷冻对移植气管抗原性的影响。方法:(1)无菌切取兔颈部气管,修剪成气管片,随机分为玻璃化快速降温组、程控缓慢降温组、新鲜未冷冻组3组,通过HE染色、TUNEL染色及透射电镜、扫描电镜等检查,评价不同冷冻方法对气管粘膜上皮及纤毛、软骨细胞的影响。(2)切取5个环的气管段,分为玻璃化冷冻组(C)、新鲜未冷冻组(B)和自体移植对照组(A),分别实施原位移植,从实验动物的存活率、移植气管的通畅度、淋巴细胞的浸润、软骨评分、墨汁灌注再血管化等方面评价冷冻对气管移植抗原性的影响。结果:(1)两种方法保存的气管均能保持其组织和结构完整,粘膜上皮及其纤毛结构、软骨细胞形态保持良好,软骨板完整;与传统程控缓慢降温相比,快速降温冷冻对软骨细胞损伤轻,有更高的软骨细胞存活率(P<0.01),TUNEL阳性细胞少(P<0.01),粘膜上皮半定量评分显示前者有更完整的粘膜上皮和纤毛的覆盖,但两者之间无统计学差异(P>0.05),两组冷冻后的粘膜上皮与正常粘膜上皮无明显差别。(2)气管段原位移植,术后各组动物均成活,C组与A组实验动物存活超过4w,移植气管管腔通畅,管体结构完整,淋巴细胞的浸润少,半定量软骨积分和淋巴细胞浸润积分显示:A组和C组的软骨积分均高于B组(P<0.05),A组和C组之间软骨积分并无明显差异(P>0.05);C组淋巴细胞浸润面积明显少于B组(P<0.01),而A、C两组之间并无明显差异(P>0.05),仅从数字上看,C组的淋巴细胞浸润面积要高于A组。A、C两组可见再生的小血管,新鲜未冷冻移植组动物均在2w内死于呼吸道狭窄梗阻,见明显的淋巴细胞浸润,未见明显小血管再生。结论:(1)玻璃化快速降温获得较高的软骨细胞的复苏率,粘膜上皮及纤毛结构完整,较好地保持气管形态结构,其保存效果优于传统缓慢降温的保存效果,对组织细胞损伤小。(2)同种异体气管移植后仍面临移植排斥反应,玻璃化冷冻可以极大地削减移植气管的抗原性,原位移植后气管的结构完整,管腔通畅,可以达到气道重建的目的。