【摘 要】
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哺乳动物中卵泡颗粒细胞的增殖对促进卵泡发育和提高排卵率具有重要意义。非编码RNA广泛参与雌性动物体内卵泡发育、颗粒细胞增殖以及卵母细胞成熟等过程,其中miRNA和lnc RNA能以内源竞争性RNA（ce RNA）的形式共同参与调控。然而,目前调控山羊卵泡颗粒细胞生长发育的ce RNA互作网络研究较少。本研究在实验室前期云上黑山羊卵巢组织全转录组测序结果上,获得重要候选基因WNT11与山羊多羔性状显
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哺乳动物中卵泡颗粒细胞的增殖对促进卵泡发育和提高排卵率具有重要意义。非编码RNA广泛参与雌性动物体内卵泡发育、颗粒细胞增殖以及卵母细胞成熟等过程,其中miRNA和lnc RNA能以内源竞争性RNA（ce RNA）的形式共同参与调控。然而,目前调控山羊卵泡颗粒细胞生长发育的ce RNA互作网络研究较少。本研究在实验室前期云上黑山羊卵巢组织全转录组测序结果上,获得重要候选基因WNT11与山羊多羔性状显著相关,整合全转录组分析发现chi-miR-1343和lnc＿000466可能是调控WNT11表达的重要调控元件,基于以上研究结果,本研究拟通过体外培养山羊卵泡颗粒细胞,过表达/干扰候选靶基因及其调控元件,解析lnc＿000466介导chi-miR-1343靶向WNT11调控山羊颗粒细胞增殖的分子机制。主要研究结果如下:1.WNT11调控山羊卵泡颗粒细胞增殖的结果显示,通过实时荧光定量与Western Blot试验,WNT11在高产组云上黑山羊卵巢中的表达量显著高于低产组（P＜0.05）;在山羊卵泡颗粒细胞中过表达WNT11后,细胞增殖因子（CDK4、CCND1、CCND2）的m RNA和蛋白表达量显著上升（P＜0.05）,细胞凋亡因子（Caspase3、Caspase9、Beclin1）的表达量显著下降（P＜0.05）;细胞计数试剂盒-8（CCK-8）和5-乙炔基-2-脱氧尿苷（Ed U）检测显示,过表达WNT11促进颗粒细胞增殖（P＜0.05）;ELISA试验显示,颗粒细胞中雌二醇（E2）与孕酮（P4）的分泌量也在过表达WNT11后显著增多（P＜0.05）;干扰WNT11后,这些结果则呈相反的趋势。2.chi-miR-1343对WNT11表达量调控显示,在高/低产云上黑山羊卵巢组织中chi-miR-1343与WNT11的表达模式相反（P＜0.05）,在山羊颗粒细胞中过表达chi-miR-1343抑制了WNT11的m RNA和蛋白表达水平（P＜0.05）;双荧光素酶报告基团结果表明,WNT11是chi-miR-1343的靶基因;在颗粒细胞中转染chi-miR-1343的模拟物和抑制剂后发现,chi-miR-1343在颗粒细胞中通过靶向WNT11基因抑制颗粒细胞增殖,促进颗粒细胞凋亡;ELISA结果表明,过表达chi-miR-1343,颗粒细胞E2及P4含量明显下降（P＜0.05）,而抑制chi-miR-1343则呈现相反的结果。3.在lnc＿000466-chi-miR-1343-WNT11调控通路的研究中,双荧光素酶报告基团表明lnc＿000466可以竞争性的结合chi-miR-1343;RT-q PCR检测发现,lnc＿000466在高低产云上黑山羊卵巢的表达模式与chi-miR-1343相反,lnc＿000466过表达后,chi-miR-1343的表达显著降低（P＜0.05）,而干扰lnc＿000466的结果则相反;在颗粒细胞中过表达lnc＿000466,Ed U和CCK-8检测发现,lnc＿000466促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡,而干扰lnc＿000466则抑制颗粒细胞增殖并促进凋亡;过表达lnc＿000466后,WNT11蛋白表达量上升,RIP结果显示,lnc＿000466与WNT11存在RNA-蛋白复合物。综上所述,WNT11基因在促进颗粒细胞增殖和抑制颗粒细胞凋亡中发挥重要作用,并能促进其E2和P4的分泌,而chi-miR-1343通过靶向WNT11抑制颗粒细胞增殖和E2与P4的分泌,并促进颗粒细胞凋亡;lnc＿000466是chi-miR-1343的ce RNA,能促进颗粒细胞增殖并抑制其凋亡。本研究初步揭示了chi-miR-1343-Lnc＿000466-WNT11的ce RNA调控网络对颗粒细胞增殖的作用,以期为山羊颗粒细胞的发育及山羊多排卵的分子机制提供参考。
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