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胆红素氧化酶(EC1.3.3.5)，系多铜氧化酶家族中的一个成员，因其能催化胆红素氧化为胆绿素而得名。本文从玉米叶片病斑中分离出一株产胆红素氧化酶菌株，通过一系列的生物化学手段纯化出胞外胆红素氧化酶，继而对该酶生化、酶学、光谱学、电磁学、电化学特性及制作成酶电极检测血液中葡萄糖含量等应用作了研究，其结果如下: (1)胆红素氧化酶产生菌的分离与鉴定 利用常规的微生物分离培养技术，从玉米叶片的病斑中分离出一株产胆红素氧化酶(BOD)的真菌。在原始发酵液中其酶活为1000 U/L。通过形态学、生理学特征和rDNA-ITS（登录号为JN251106）序列分析，该菌株被鉴定为Bipolaris australiensis，命名为HD-1，属子囊菌门、格孢腔菌目、格孢腔菌科、平脐蠕孢属的澳大利亚平脐蠕孢霉(B.australiensis)，亦称澳洲双孢霉，是一株没有被报道过的具有较高BOD酶活性的新菌株，为BOD的产生提供了新的资源。 (2)产酶条件的优化 通过单因素试验从供试的13种碳源、22种氮源中找到了适合B.aurtraliensis HD-1产生BOD的适宜碳源为麦芽糖、庶糖、葡萄糖、果糖、可溶性淀粉及海藻糖。适宜的氮源有聚蛋白胨、大豆蛋白胨、豆饼粉。适宜的诱导剂为CuSO4。通过二水平部分因子试验及最陡爬坡试验设计，从碳源、氮源、诱导剂、培养温度、培养基初始pH及摇床转速七个因素中找到了对BOD产量影响最显著的三个因素即麦芽糖含量、发酵温度和CuSO4含量，通过最陡爬坡试验寻找到了逼近实验的中心点后，利用响应面法中的BB设计对上述三个主要因素进行优化，得到:当培养基质中初始组成含量（g/L）为:麦芽糖5，硫酸铜0.32，大豆蛋白胨50;发酵条件为:29.8℃，pH6.8，摇床转速为150 rpm，发酵培养6d，可获得理论上最高酶活为2480 U/L，验证实验酶活达到2180 U/L，表明响应面法优化BOD的实验结果可靠，通过发酵条件的优化酶活比优化前提高了2.5倍。 (3)酶蛋白的纯化和鉴定 将B.aurtraliensis HD-1发酵液通过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤层析纯化后，经native-PAGE和SDS-PAGE检测，获得了具有BOD活性的电泳纯单体蛋白，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)法测定断裂后的蛋白质片段序列，获得135个氨基酸，利用Mascot软件在NCBI蛋白库中时行比对的结果表明，该蛋白与来源于Helminthosporium tritici-vulgaris(燕麦长蠕孢霉)的漆酶前体蛋白序列同源性达100％。测定该酶蛋白表观分子量为68 kDa，pI4.1。 (4)光谱学和电磁学特性 电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)法测得该酶含Cu,Zn,Fe原子，每分子BOD蛋白中含Cu、Zn、Fe原子的比率为1∶1∶4; UV-vis光谱学分析表明该蛋白具有典型多铜氧化酶家族的光谱学特性，即T1铜在600 nm附近有一强吸收峰及T2、T3铜组成的三核铜中心在330 nm附近有一肩(shoulder)状峰，所不同的是，该酶在340 nm和773 nm处各有一强吸收峰。电子顺磁共振(ESR)检测表明，酶在近中性(pH7.3)，-160℃条件下表现为静默状态。认为该蛋白是种新的胆红素氧化酶。 (5)酶学特性 不同底物的米氏常数(Km)值分别为Km(ABTS)=1.8×10-5(mol/L)(pH3.0)和Km(bilirubin）=2.7×10-5(mol/L)(pH7.5);该酶对胆红素的最适催化活性为36℃，酶在低温下稳定;在高pH下可保持相当高的催化胆红素活性;该BOD能够耐受高浓度的硝酸钠和尿素;低浓度的叠氮化钠和Trisbase对酶活有促进作用而高浓度则表现为抑制;该酶对氯化钠、磷酸钠、硫酸钠、有机磷类农药及复合型农药百虫灵、溶解氧敏感。Cu2+和Hg2+在BOD不存在的条件下，二者可氧化胆红素为胆绿素，但产物不是唯一的;胆红素在BOD不存在时，可与溶液中的Li+、Na+、K+、Mn2+、Ba2+、Co2+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Ca2+络合形成配合物，结合后的胆红素不能被酶催化。结合该酶的酶学及光谱学特性说明此酶为一新的胆红素氧化酶。 (6)电化学特性及应用 通过循环伏安法研究了BOD吸附在经羧基化的多壁碳纳米微管修饰的玻碳电极上的循环伏安曲线，表明在空气饱和的5mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系(pH7.3)中，获得了表观电势|ΔEP|=107 mV(vs.SCE)，|iPa/iPc|=0.7，证明体系发生了准可逆氧化还原反应，说明B.australiensis HD-1 BOD与玻碳电极间发生了异源电子直接转移现象。利用羧基化的多壁碳纳米微管及Nafion膜溶液可有效增加玻碳电极的表面积，提高了吸附在电极上的酶量和电化学信号，延长了酶电极的使用时间，便于酶的直接电子转移。用该电极通过LSV法可快速地检测血样中微量葡萄糖浓度(0～15μM)，且可信度较高，为该酶电极在临床上应用奠定了理论基础。