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目的:卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)是目前唯一批准使用于人体的结核病防治疫苗,但它对成年人失去免疫保护效果。本课题以探讨BCG诱导宿主细胞因子释放以及调控CD4~+T细胞记忆形成机制为出发点,首先优化了中央型记忆T(TCM)和效应型记忆T(TEM)的分子标识CD62L的体外检测条件,从而建立可靠的体外记忆性细胞检测体系。本课题组前期报道了 BCG能在小鼠体内诱导免疫调节因子IL-10的产生,之后我们用BCG皮下免疫小鼠诱导记忆细胞的产生,探讨在BCG免疫小鼠体内IL-10对记忆性CD4~+T细胞形成的影响。方法:1)流式细胞术检测体外胶原蛋白酶消化、37 ℃条件细胞培养以及4 ℃条件低温保存条对CD4~+T细胞CD62L表达水平的影响。2)使用不同计量的BCG皮下免疫小鼠,优化BCG免疫记忆动物模型;采用流式细胞术技术检测CD3~+CD4~+ T细胞CD44和CD62L记忆性细胞表面标志分子的表达水平。3)BCG皮下免疫小鼠,免疫后15天用ELISA技术检测免疫小鼠血清中IL-10的表达水平。同时取出小鼠脾脏细胞,流式细胞术检测脾脏中分泌IL-10细胞的类型。4)用BCG皮下免疫IL-10表达缺失鼠(IL-10-/-)和野生型小鼠,在不同时间点,用流式细胞术分别检测小鼠脾脏细胞中CD3~+CD4~+T细胞记忆性标识CD44和CD62L分子的表达;用BCG在体外再次刺激后CD3~+CD4~+T细胞的IL-4、IFN-γ和IL-17A细胞因子的表达水平。5)用Western-Blot技术检测BCG免疫小鼠的CD4~+T细胞中调控CD62L和CD44表达的金属蛋白酶17(ADAM17)的蛋白表达水平。结果:1)CD4~+T细胞表面分子CD62L在体外不耐受Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原蛋白酶消化,但D型胶原蛋白酶消化处理对CD62L表达影响较小。细胞长时间的培养(37 ℃)和保存(4℃)会影响表面标记分子CD62L的表达。2)用1×108CFU/只的剂量皮下免疫小鼠30天后,和对照组用PBS免疫组比较,实验组中央型记忆CD4~+T细胞TCM(CD3~+CD4~+CD44~+CD62L+)和效应型记忆CD4~+T细胞 TEM(CD3~+CD4~+CD44~+CD62L-)的比例显著上升。3)BCG皮下免疫小鼠15天后,小鼠血清中IL-10表达水平上升,脾脏中分泌IL-10的细胞主要是DC和巨噬细胞。4)BCG免疫能诱导IL-10-/-小鼠产生更高水平的记忆性CD4~+T细胞,其中CD44~+CD4~+T细胞的增加幅度最大。BCG抗原体外刺激免疫小鼠的脾细胞,与野生型小鼠组比较,IL-10-/-组CD4~+T细胞合成抗炎细胞因子IFN-y的表达水平显著提高,而IL-4和IL-17的表达没有差异。5)IL-10的缺失影响了 CD4~+T细胞内ADAM17的蛋白表达水平,IL-10-/-小鼠CD4~+T细胞的ADAM17的蛋白表达显著下降。结论:1)记忆性T细胞的表面分子标志CD62L表达对胶原酶D消化处理更具耐受性。细胞长时间培养(37 ℃)和保存(4 ℃)导致表面标记分子CD62L表达的波动。因此合适的细胞分离和培养步骤对检测CD62L的表达十分重要,特别是通过流式细胞术检测记忆性T细胞操作时。2)高剂量BCG皮下免疫后,小鼠体内记忆性CD4~+T细胞比例显著提高;IL-10的缺失有利于记忆性CD4~+T细胞比例的上升,能提高小鼠免疫记忆能力。