一、研究目的腰椎黄韧带肥厚（hypertrophy of the lumbar ligamentum flavum）可与其他多种因素共同作用造成继发性腰椎管狭窄（lumbar spinal stenosis,LSS）,其主要临床表现为腰痛、神经根性疼痛、下肢麻木、间歇性跛行等。目前,对腰椎黄韧带肥厚的研究主要集中于形态学和组织学方面,通过手术解除马尾及神经根压迫是当前主要治疗方式,其病理机制尚不明确。黄韧带肥厚的特征性组织学变化为弹性纤维减少、排列紊乱、撕裂并逐渐消失,胶原纤维增加,最终导致黄韧带纤维化。TGF-β1、FGF、VEGF、MMP/TIMP等细胞因子参与黄韧带肥厚的进展。研究表明随着年龄的增长,体内氧自由基（reactive oxygen species,ROS）堆积,导致细胞线粒体功能受损,而氧自由基的堆积与组织器官退变密切相关。在多种组织器官中TGF-β1、FGF-2可通过ERK或NF-κB信号通路促进胶原蛋白的合成增加,进而加速组织退变。本研究旨在明确氧自由基对腰椎黄韧带肥厚的影响,探讨其是否通过刺激黄韧带细胞产生TGF-β1、FGF-2,进而激活ERK1/2-NF-κB信号通路发挥作用。二、研究方法（一）人腰椎黄韧带细胞的分离、培养分离与培养:将术中获取的腰椎黄韧带标本无菌条件下以生理盐水冲洗,无菌刀片去除非韧带组织,组织块贴壁法分离黄韧带细胞,细胞量达显微镜低倍镜视野70%-80%融合时进行细胞传代,取第4代-第6代细胞传代至60×15mm培养皿中实验干预。（二）H₂O₂干预后黄韧带肥厚相关指标基因及蛋白水平的表达分组:分为正常对照组、H₂O₂浓度50μmol/L组、100μmol/L组、150μmol/L组、200μmol/L组。q RT-PCR:按照实验分组应用H₂O₂对腰椎黄韧带细胞进行干预72h,分别提取细胞总RNA,然后对TGF-β1、FGF-2、CollagenⅠ、CollagenⅢ、NF-κB进行PCR检测,观察各指标m RNA的相对表达量。Western-blot:按照实验分组应用H₂O₂对腰椎黄韧带细胞进行干预72h,分别提取细胞总蛋白,然后对TGF-β1、FGF-2、CollagenⅠ、CollagenⅢ、NF-κB进行western-blot检测,观察各指标蛋白水平的相对表达。（三）ERK1/2、NF-κB通路的验证ERK1/2通路检测:200μM浓度的H₂O₂对腰椎黄韧带细胞进行干预,干预时间分别为5min、10min、15min、20min、30min、60min,采用western-blot检测p-ERK1/2的蛋白表达。NF-κB通路检测:200μM浓度的H₂O₂对腰椎黄韧带细胞进行干预,干预时间分别为10min、20min、30min、60min、90min、120min,采用western-blot检测p-p65的蛋白表达。通路阻断:（1）H₂O₂浓度200μM,分别采用H₂O₂、H₂O₂+HY-15947（ERK1/2通路抑制剂）、H₂O₂+Bay11-7082（NF-κB抑制剂）、H₂O₂+S7959（TGF-β抑制剂）、H₂O₂+NSC37204（FGF-2抑制剂）对腰椎黄韧带细胞干预72h,western-blot检测CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白水平表达。（2）200μM浓度H₂O₂+S7959、200μM浓度H₂O₂+NSC37204对腰椎黄韧带细胞分别干预15min、20min,应用western-blot检测p-ERK1/2的蛋白表达;200μM浓度H₂O₂+S7959、200μM浓度H₂O₂+NSC37204对腰椎黄韧带细胞分别干预60min、90min,应用western-blot检测p-p65的蛋白表达,验证上下游通路。三、研究结果（一）人腰椎黄韧带细胞的分离、培养组织块贴壁培养法分离细胞,样本组织于第14天开始有细胞迁移长出,以组织块为中心向外生长。细胞形态呈长梭形,部分细胞呈不规则多角形或椭圆形,胞体平坦,体积适中,胞质透亮,细胞核较大,椭圆形,多为单个核。（二）H₂O₂干预后黄韧带肥厚相关指标基因及蛋白水平的表达与对照组相比,各实验组CollagenⅢ的m RNA相对水平表达均显著升高（p<0.01）;CollagenⅠ的m RNA相对水平表达仅在H₂O₂浓度200μM时显著增高（p<0.05）;TGF-β1、FGF-2、NF-κB的m RNA相对水平表达在H₂O₂浓度150μM、200μM组时显著升高,差异有统计学意义（p<0.05）。与对照组相比,实验组TGF-β1、FGF-2、CollagenⅠ、CollagenⅢ、NF-κB蛋白相对表达水平随H₂O₂浓度的增加而显著增加。（三）ERK1/2、NF-κB通路的验证ERK1/2通路检测:200μM浓度的H₂O₂干预腰椎黄韧带细胞后p-ERK1/2蛋白水平表达增加;NF-κB通路检测:200μM浓度的H₂O₂干预腰椎黄韧带细胞后p-p65蛋白水平表达增加;通路阻断:（1）200μM浓度H₂O₂+S7959、200μM浓度H₂O₂+NSC37204分别干预15min、20min后,p-ERK1/2的蛋白相对表达水平较前显著降低;200μM浓度H₂O₂+S7959、200u M浓度H₂O₂+NSC37204分别干预60min、90min后,p-p65的蛋白相对表达水平较前显著降低;（2）200μM浓度H₂O₂+HY-15947、H₂O₂+Bay11-7082、H₂O₂+S7959、H₂O₂+NSC37204对腰椎黄韧带细胞干预72h,western-blot检测CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白相对水平表达较对照组显著降低。四、结论1.通过组织块贴壁培养法获得人腰椎黄韧带细胞可作为良好的细胞分离培养方法用于黄韧带增生肥厚的分子生物学研究。2.氧自由基H₂O₂堆积可促进腰椎黄韧带细胞TGF-β1、FGF-2、CollagenⅠ、CollagenⅢ表达增加。3.氧自由基H₂O₂通过刺激黄韧带细胞产生TGF-β1、FGF-2,进而激活ERK1/2-NF-κB信号通路,参与腰椎黄韧带肥厚的病理发展过程。