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目的:肝癌在我国发病率占世界的50%以上,目前尚缺乏有效的治疗措施。二芳基庚烷类化合物—桤木酮(Alnustone)具有抗菌、抗炎、抗肿瘤及免疫调节等广泛的生物活性。其抗肿瘤作用的机理尚不清楚。本研究我们通过体内外实验,证实桤木酮对肝癌具有良好的抗肿瘤作用,其研究结果为发展桤木酮作为抗肿瘤药物奠定基础。
方法:采用CCK-8法测定桤木酮对不同肿瘤细胞活力的影响。通过Hoechst33342/PI双染以及流式细胞术观察桤木酮对肿瘤细胞形态学的变化及凋亡的影响。采用JC-1(CBIC2)染色、激光共聚焦技术观测桤木酮作用肿瘤细胞后引起的线粒体膜电位变化,利用荧光探针(DCFH-DA)技术在荧光倒置显微镜下观测活性氧(ROS)的生成。采用细胞克隆形成实验测定桤木酮对肝癌细胞增殖的影响。采用Western Blot测定桤木酮对肝癌细胞线粒体凋亡通路相关蛋白以及PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路蛋白表达的影响。研究了在抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcystein,NAC)存在条件下桤木酮对肝癌细胞产生ROS的影响。通过建立肝癌细胞HepG2裸鼠移植性肿瘤模型,测定桤木酮体内抗肿瘤活性,利用组织病理学HE染色与TUNEL染色法研究了桤木酮对肿瘤组织的影响。
结果:我们首先利用CCK-8技术检测了桤木酮对不同肿瘤细胞的抑制作用,结果显示桤木酮能够抑制多种肿瘤细胞的增长,对肝癌细胞BEL-7402与HepG2的IC50分别为69.13±1.09μM与49.45±1.35μM。Hoechst33342/PI荧光双染结果表明,肿瘤细胞经不同浓度的桤木酮干预72h后,桤木酮给药组呈现细胞核固缩、胞膜发泡、凋亡小体等明显的凋亡现象。Annexin V-FITC/PI荧光双染流式细胞术结果显示,桤木酮处理肝癌细胞BEL-7402和HepG2后,其凋亡率分别为24.04±2.03%和23.73±3.58%。利用荧光探针JC-1(CBIC2)联合流式细胞术检测线粒体膜电位变化,结果显示,桤木酮处理可以导致肿瘤细胞线粒体膜电位下降,激光共聚焦技术也观察到肝癌细胞BEL-7402与HepG2线粒体膜电位的改变。上述结果说明桤木酮可以通过改变细胞线粒体膜电位、诱导肝癌细胞凋亡。由于活性氧(reactive oxygen species,ROS)与肿瘤凋亡密切相关,我们测定了桤木酮处理后对肿瘤细胞ROS的影响,结果表明桤木酮可以显著促进肿瘤细胞的ROS的产生,进而我们研究了在活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcystein,NAC)存在条件下,桤木酮对肝癌生长的抑制作用,结果表明,NAC可以逆转桤木酮对肝癌细胞生长的抑制作用。与单独应用桤木酮相比,在NAC存在条件下,桤木酮抑制肝癌细胞的克隆形成能力显著降低,NAC与桤木酮联合应用,BEL-7402的克隆形成抑制率由98.92%转为增殖作用,HepG2也呈现类似的结果。上述实验说明桤木酮可以通过ROS介导的途径诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肝癌细胞生长。我们利用Western Blot检测了桤木酮对肝癌细胞凋亡基因表达的影响,结果显示,桤木酮可以促进线粒体凋亡通路相关蛋白PARP、P53、Bax、Cytochrome C、Apaf-1、Cleaved Caspase-3表达,抑制Bcl-2蛋白表达。我们进一步研究发现,NAC可以部分逆转桤木酮对凋亡基因的调控作用。采用Western Blot研究了桤木酮对PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路的影响,结果表明桤木酮可以抑制PI3K、Akt、mTOR磷酸化,抑制p70S6K表达,PI3K通路激活剂(1,3-二咖啡酰奎宁酸)可逆转桤木酮对PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路的调节作用,而PI3K通路抑制剂(LY294002)可以促进桤木酮对PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路的影响。NAC可以部分逆转桤木酮对PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路的抑制作用,上述实验结果证实,桤木酮可以通过ROS介导的PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路诱导肝癌细胞凋亡。我们利用裸鼠移植瘤模型研究了桤木酮的体内抗肿瘤作用,结果表明桤木酮对HepG2肝癌移植瘤具有显著的抑制作用,25、50、100mg/kg i.p.给药,抑瘤率分别为34.48%、56.52%、68.83%,与阳性对照药的作用类似。Western Blot法检测肿瘤组织蛋白结果表明,P53、Cleaved Caspase-9蛋白的表达量增加,而Caspase-3、Caspase-9的表达显著降低。瘤组织切片HE染色病理检测显示,空白对照组瘤体大,可见双核,核质较高呈嗜碱性,且肿瘤细胞间可见少量分叶核或杆状核的中性粒细胞与巨核瘤细胞浸润。随着给药浓度的增加,瘤体逐渐减小。TUNEL法对裸鼠肿瘤组织进行染色,结果表明桤木酮可以诱导肿瘤组织细胞凋亡。
结论:本研究证实桤木酮可以通过诱导ROS的生成,抑制PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路,促进肝癌细胞线粒体凋亡。体内实验表明桤木酮能够显著抑制HepG2裸鼠移植瘤生长,桤木酮有成为新的抗肝癌治药物或作为抗肝癌药物前体的潜力。
方法:采用CCK-8法测定桤木酮对不同肿瘤细胞活力的影响。通过Hoechst33342/PI双染以及流式细胞术观察桤木酮对肿瘤细胞形态学的变化及凋亡的影响。采用JC-1(CBIC2)染色、激光共聚焦技术观测桤木酮作用肿瘤细胞后引起的线粒体膜电位变化,利用荧光探针(DCFH-DA)技术在荧光倒置显微镜下观测活性氧(ROS)的生成。采用细胞克隆形成实验测定桤木酮对肝癌细胞增殖的影响。采用Western Blot测定桤木酮对肝癌细胞线粒体凋亡通路相关蛋白以及PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路蛋白表达的影响。研究了在抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcystein,NAC)存在条件下桤木酮对肝癌细胞产生ROS的影响。通过建立肝癌细胞HepG2裸鼠移植性肿瘤模型,测定桤木酮体内抗肿瘤活性,利用组织病理学HE染色与TUNEL染色法研究了桤木酮对肿瘤组织的影响。
结果:我们首先利用CCK-8技术检测了桤木酮对不同肿瘤细胞的抑制作用,结果显示桤木酮能够抑制多种肿瘤细胞的增长,对肝癌细胞BEL-7402与HepG2的IC50分别为69.13±1.09μM与49.45±1.35μM。Hoechst33342/PI荧光双染结果表明,肿瘤细胞经不同浓度的桤木酮干预72h后,桤木酮给药组呈现细胞核固缩、胞膜发泡、凋亡小体等明显的凋亡现象。Annexin V-FITC/PI荧光双染流式细胞术结果显示,桤木酮处理肝癌细胞BEL-7402和HepG2后,其凋亡率分别为24.04±2.03%和23.73±3.58%。利用荧光探针JC-1(CBIC2)联合流式细胞术检测线粒体膜电位变化,结果显示,桤木酮处理可以导致肿瘤细胞线粒体膜电位下降,激光共聚焦技术也观察到肝癌细胞BEL-7402与HepG2线粒体膜电位的改变。上述结果说明桤木酮可以通过改变细胞线粒体膜电位、诱导肝癌细胞凋亡。由于活性氧(reactive oxygen species,ROS)与肿瘤凋亡密切相关,我们测定了桤木酮处理后对肿瘤细胞ROS的影响,结果表明桤木酮可以显著促进肿瘤细胞的ROS的产生,进而我们研究了在活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcystein,NAC)存在条件下,桤木酮对肝癌生长的抑制作用,结果表明,NAC可以逆转桤木酮对肝癌细胞生长的抑制作用。与单独应用桤木酮相比,在NAC存在条件下,桤木酮抑制肝癌细胞的克隆形成能力显著降低,NAC与桤木酮联合应用,BEL-7402的克隆形成抑制率由98.92%转为增殖作用,HepG2也呈现类似的结果。上述实验说明桤木酮可以通过ROS介导的途径诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肝癌细胞生长。我们利用Western Blot检测了桤木酮对肝癌细胞凋亡基因表达的影响,结果显示,桤木酮可以促进线粒体凋亡通路相关蛋白PARP、P53、Bax、Cytochrome C、Apaf-1、Cleaved Caspase-3表达,抑制Bcl-2蛋白表达。我们进一步研究发现,NAC可以部分逆转桤木酮对凋亡基因的调控作用。采用Western Blot研究了桤木酮对PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路的影响,结果表明桤木酮可以抑制PI3K、Akt、mTOR磷酸化,抑制p70S6K表达,PI3K通路激活剂(1,3-二咖啡酰奎宁酸)可逆转桤木酮对PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路的调节作用,而PI3K通路抑制剂(LY294002)可以促进桤木酮对PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路的影响。NAC可以部分逆转桤木酮对PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路的抑制作用,上述实验结果证实,桤木酮可以通过ROS介导的PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路诱导肝癌细胞凋亡。我们利用裸鼠移植瘤模型研究了桤木酮的体内抗肿瘤作用,结果表明桤木酮对HepG2肝癌移植瘤具有显著的抑制作用,25、50、100mg/kg i.p.给药,抑瘤率分别为34.48%、56.52%、68.83%,与阳性对照药的作用类似。Western Blot法检测肿瘤组织蛋白结果表明,P53、Cleaved Caspase-9蛋白的表达量增加,而Caspase-3、Caspase-9的表达显著降低。瘤组织切片HE染色病理检测显示,空白对照组瘤体大,可见双核,核质较高呈嗜碱性,且肿瘤细胞间可见少量分叶核或杆状核的中性粒细胞与巨核瘤细胞浸润。随着给药浓度的增加,瘤体逐渐减小。TUNEL法对裸鼠肿瘤组织进行染色,结果表明桤木酮可以诱导肿瘤组织细胞凋亡。
结论:本研究证实桤木酮可以通过诱导ROS的生成,抑制PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路,促进肝癌细胞线粒体凋亡。体内实验表明桤木酮能够显著抑制HepG2裸鼠移植瘤生长,桤木酮有成为新的抗肝癌治药物或作为抗肝癌药物前体的潜力。