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目的:瞬时受体电位离子通道3(transient receptor potential3channels,TRPC3)是一种非电压门控非选择性的阳离子通道,也是心脏纤维化和心房颤动(AF)发病的重要介质。心房纤维化诱导的心脏重塑主要基于细胞外基质(ECM)积累。TRPC3在心脏中的病理生理作用在很大程度上基于其在成纤维细胞中的表达和功能。因此,TRPC3被认为是促进心肌纤维化、结构重构和心律失常尤其是AF导致的细胞增殖和分化的关键因素。有研究表明,上调TRPC3的表达可以促进成纤维细胞分化为肌成纤维细胞,而抑制TRPC3可以减少ROS的产生,改善线粒体功能,进而减少AF的发生。在衰老和高血压患者中,TRPC3也可能参与了心房发生纤维化的过程,然而TRPC3通道是否在老龄及高血压心房纤维化过程中发生重要作用却并不清楚,因此本研究开展了以下的实验,以探讨TRPC3在老龄和高血压状态下参与心房纤维化形成的分子机制。
方法:1、应用病理学方法和电镜技术检测老龄及高血压心脏的结构和功能的变化:(1)将实验大鼠分为WKY(Wistar)组(4月龄,4m-o,正常血压)、WKY组(24月龄,24m-o,正常血压)、SHR(Spontaneously hypertensive rats)组(4月龄,4m-o,高血压)和SHR组(24月龄,24m-o,高血压),采用股动脉插管等方法进行血压、心率等一般情况测量;(2)通过心脏切片H&E染色、Masson染色和透射电镜成像法观察心肌组织病理学改变和超微结构改变;2、Western blotting技术检测WKY(4m-o、24m-o)和SHR(4m-o、24m-o)四组大鼠心房组织中TRPC3及纤维化生物标志物TGF-β1、Col-Ⅰ(CollagenⅠ)、Col-Ⅲ(CollagenⅢ)、AT1R(AngiotensinⅡtype1receptor)、AT2R(AngiotensinⅡtype2receptor)的表达情况。3、使用慢病毒TRPC3RNAi感染心房成纤维细胞以干扰TRPC3的表达,然后对TGF-β1进行蛋白检测。4、TRPC3参与心房成纤维细胞的迁移和增殖:Transwell细胞侵袭实验和细胞划痕实验。5、使用Fura-2荧光染钙,采用酶标仪检测心房成纤维细胞的胞内钙变化,检测TRPC3选择性阻断剂Pyr3对血管紧张素2(AngⅡ)诱导的细胞内Ca2+释放的影响。6、Pyr3对AngⅡ诱导的细胞外基质蛋白沉积的影响:在新生大鼠心房成纤维细胞中,分别处理AngⅡ、Pyr3和AngⅡ+Pyr3联合用药,用Western blotting检测TRPC3、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1、periostin、p-Smad2/3、Smad2/3的表达情况。7、AngⅡ可能通过AT1R调节TRPC3的功能:在新生大鼠心房成纤维细胞中,分别处理AngⅡ、AngⅡ+缬沙坦(AT1受体选择性阻断剂)和AngⅡ+PD123319(AT2受体选择性阻断剂)联合用药,Western blotting检测TRPC3的表达变化。
结果:1、老龄及高血压大鼠心房基本情况、心房肌组织病理和超微结构的变化:(1)体重:与WKY4m-o组相比,WKY24m-o和SHR24m-o的体重均有明显增加,SHR4m-o的体重无明显差异;(2)收缩压:与WKY4m-o(113.87±13.59,mmHg)和WKY24m-o(134.00±7.34,mmHg)相比,SHR4m-o(189.62±23.79,mmHg)和SHR24m-o(184.87±19.72,mmHg)的收缩压显著升高(n=8,P<0.01);(3)舒张压:与WKY4m-o(91.75±26.47,mmHg)和WKY24m-o(94.25±10.87,mmHg)相比,SHR4m-o(141.12±16.64,mmHg)和SHR24m-o(130.37±18.39,mmHg)的舒张压显著升高(n=8,P<0.01);(4)各组间心率和血糖无明显差异。(5)各组心房组织结构的病理学变化和超微结构的变化:与WKY4m-o相比,H&E染色结果发现WKY24m-o、SHR4m-o和SHR24m-o心房组织的细胞外基质(ECM)显著增加;同时心脏肌肉被细胞外基质分成更多的分支,每个分支之间的空间更宽,细胞核不对齐。在老龄和高血压大鼠心房组织切片使用Masson染色,结果发现与WKY4m-o相比,WKY24m-o、SHR4m-o和SHR24m-o的蓝色胶原明显增加,且电镜结果也表明,老龄及高血压大鼠细胞与细胞之间存在胶原原纤维。2.老龄及高血压大鼠心房肌TRPC3及纤维化生物标志物(如Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1)的基因和蛋白表达均明显增加:(1)qRT-PCR结果显示:与WKY4m-o组相比,老龄及高血压大鼠心房组织TRPC3mRNA的相对表达量,WKY24m-o组(0.98±0.06vs1.20±0.09)、SHR4m-o组(0.98±0.06vs1.22±0.04)表达增加;与WKY4m-o组相比,Col-ⅠmRNA的相对表达量,WKY24m-o(3.05±1.56vs12.35±2.13,P<0.05)、SHR4m-o(3.05±1.56vs21.65±3.14,P<0.01)和SHR24m-o(3.05±1.56vs13.15±2.56,P<0.05)均明显增加;同时与WKY4m-o组相比,Col-ⅢmRNA的表达变化,在WKY24m-o组(1.36±0.58vs5.26±0.78,P<0.01),SHR4m-o组(1.36±0.58vs3.67±0.13,P<0.05)和SHR24m-o组(1.36±0.58vs5.15±0.26,P<0.01)也明显增加;与WKY4m-o(0.96±0.56)组相比,TGF-β1的mRNA水平,在WKY24m-o组(2.87±0.48,P<0.01),SHR4m-o组(1.93±0.35,P<0.05)和SHR24m-o组(1.78±0.08,P<0.05)的mRNA水平均明显增加;(2)Western blotting结果显示:老龄及高血压大鼠心房肌TRPC3、纤维化生物标志物蛋白表达均增加;与WKY4m-o组(2.11±0.32)相比,TRPC3的蛋白表达量在WKY24m-o组(2.72±0.24,P<0.05)和SHR4m-o组(3.20±0.03,P<0.01)表达均明显增加;与WKY4m-o组相比,Col-Ⅰ蛋白水平,在SHR4m-o组(4.94±0.08vs8.45±0.38,P<0.01)和SHR24m-o组(4.94±0.08vs7.54±0.23,P<0.05)明显增加;与WKY4m-o组相比,Col-Ⅲ的蛋白表达在WKY24m-o组(2.15±0.32vs1.02±0.007,P<0.05)和SHR4m-o组(1.89±0.04vs1.02±0.007,P<0.05)明显增加。与WKY4m-o组相比,TGF-β1蛋白表达在WKY24m-o组(2.15±0.32vs1.02±0.007,P<0.01),SHR4m-o组(1.95±0.04vs1.02±0.007,P<0.01)和SHR24m-o(1.83±0.11vs1.02±0.007,P<0.05)心房组织中均明显增加。3.慢病毒TRPC3RNAi感染心房成纤维细胞对纤维化标志物蛋白表达的影响:慢病毒TRPC3RNAi感染心房成纤维细胞72小时后,发现TRPC3表达下调可明显降低TGF-β1(0.47±0.04vs0.32±0.032,P<0.05)的表达;;4.TRPC3通道阻断剂对AngⅡ诱导的细胞增殖和迁移的抑制作用:(1)划痕实验:细胞贴壁生长到细胞融合度70-80%进行划痕实验,在TRPC3通道阻断剂处理0小时和48小时的细胞进行划痕实验成像,与对照组相比,AngⅡ组的成纤维细胞增殖明显增加,而TRPC3通道阻滞剂Pyr3可明显抑制AngⅡ导致的成纤维细胞的增殖。(2)迁移实验:Transwell迁移法检测细胞迁移,AngⅡ能显著增加成纤维细胞的迁移,而Pyr3能降低AngⅡ刺激下成纤维细胞的迁移(n=4,P<0.01);5.TRPC3特异性阻滞剂Pyr3对AngⅡ诱导的细胞内Ca2+释放的影响:在无钙溶液条件下,Pyr3能显著降低钙瞬变的幅度(n=6,P<0.05),加入1μmol/L AngⅡ后,Control组和Pyr3预处理组的钙瞬变值与无钙条件下幅度明显增强;将溶液转变为1.8mmol/L CaCl2,相较于加入AngⅡ时,对照组和Pyr3预处理组的钙瞬变值均明显增强,而Pyr3预处理的钙瞬变值明显低于对照组(n=6,P<0.05);
结论:1.老龄和高血压可导致心房纤维化;2.TRPC3在老龄和高血压心房中表达明显上调。3.TRPC3经AT1R/TGF-β1/Smad2/3信号通路上调参与了老龄和高血压导致的心房纤维化过程。4.TRPC3可能是老龄和高血压逆转心房纤维化的潜在的治疗靶点。
方法:1、应用病理学方法和电镜技术检测老龄及高血压心脏的结构和功能的变化:(1)将实验大鼠分为WKY(Wistar)组(4月龄,4m-o,正常血压)、WKY组(24月龄,24m-o,正常血压)、SHR(Spontaneously hypertensive rats)组(4月龄,4m-o,高血压)和SHR组(24月龄,24m-o,高血压),采用股动脉插管等方法进行血压、心率等一般情况测量;(2)通过心脏切片H&E染色、Masson染色和透射电镜成像法观察心肌组织病理学改变和超微结构改变;2、Western blotting技术检测WKY(4m-o、24m-o)和SHR(4m-o、24m-o)四组大鼠心房组织中TRPC3及纤维化生物标志物TGF-β1、Col-Ⅰ(CollagenⅠ)、Col-Ⅲ(CollagenⅢ)、AT1R(AngiotensinⅡtype1receptor)、AT2R(AngiotensinⅡtype2receptor)的表达情况。3、使用慢病毒TRPC3RNAi感染心房成纤维细胞以干扰TRPC3的表达,然后对TGF-β1进行蛋白检测。4、TRPC3参与心房成纤维细胞的迁移和增殖:Transwell细胞侵袭实验和细胞划痕实验。5、使用Fura-2荧光染钙,采用酶标仪检测心房成纤维细胞的胞内钙变化,检测TRPC3选择性阻断剂Pyr3对血管紧张素2(AngⅡ)诱导的细胞内Ca2+释放的影响。6、Pyr3对AngⅡ诱导的细胞外基质蛋白沉积的影响:在新生大鼠心房成纤维细胞中,分别处理AngⅡ、Pyr3和AngⅡ+Pyr3联合用药,用Western blotting检测TRPC3、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1、periostin、p-Smad2/3、Smad2/3的表达情况。7、AngⅡ可能通过AT1R调节TRPC3的功能:在新生大鼠心房成纤维细胞中,分别处理AngⅡ、AngⅡ+缬沙坦(AT1受体选择性阻断剂)和AngⅡ+PD123319(AT2受体选择性阻断剂)联合用药,Western blotting检测TRPC3的表达变化。
结果:1、老龄及高血压大鼠心房基本情况、心房肌组织病理和超微结构的变化:(1)体重:与WKY4m-o组相比,WKY24m-o和SHR24m-o的体重均有明显增加,SHR4m-o的体重无明显差异;(2)收缩压:与WKY4m-o(113.87±13.59,mmHg)和WKY24m-o(134.00±7.34,mmHg)相比,SHR4m-o(189.62±23.79,mmHg)和SHR24m-o(184.87±19.72,mmHg)的收缩压显著升高(n=8,P<0.01);(3)舒张压:与WKY4m-o(91.75±26.47,mmHg)和WKY24m-o(94.25±10.87,mmHg)相比,SHR4m-o(141.12±16.64,mmHg)和SHR24m-o(130.37±18.39,mmHg)的舒张压显著升高(n=8,P<0.01);(4)各组间心率和血糖无明显差异。(5)各组心房组织结构的病理学变化和超微结构的变化:与WKY4m-o相比,H&E染色结果发现WKY24m-o、SHR4m-o和SHR24m-o心房组织的细胞外基质(ECM)显著增加;同时心脏肌肉被细胞外基质分成更多的分支,每个分支之间的空间更宽,细胞核不对齐。在老龄和高血压大鼠心房组织切片使用Masson染色,结果发现与WKY4m-o相比,WKY24m-o、SHR4m-o和SHR24m-o的蓝色胶原明显增加,且电镜结果也表明,老龄及高血压大鼠细胞与细胞之间存在胶原原纤维。2.老龄及高血压大鼠心房肌TRPC3及纤维化生物标志物(如Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1)的基因和蛋白表达均明显增加:(1)qRT-PCR结果显示:与WKY4m-o组相比,老龄及高血压大鼠心房组织TRPC3mRNA的相对表达量,WKY24m-o组(0.98±0.06vs1.20±0.09)、SHR4m-o组(0.98±0.06vs1.22±0.04)表达增加;与WKY4m-o组相比,Col-ⅠmRNA的相对表达量,WKY24m-o(3.05±1.56vs12.35±2.13,P<0.05)、SHR4m-o(3.05±1.56vs21.65±3.14,P<0.01)和SHR24m-o(3.05±1.56vs13.15±2.56,P<0.05)均明显增加;同时与WKY4m-o组相比,Col-ⅢmRNA的表达变化,在WKY24m-o组(1.36±0.58vs5.26±0.78,P<0.01),SHR4m-o组(1.36±0.58vs3.67±0.13,P<0.05)和SHR24m-o组(1.36±0.58vs5.15±0.26,P<0.01)也明显增加;与WKY4m-o(0.96±0.56)组相比,TGF-β1的mRNA水平,在WKY24m-o组(2.87±0.48,P<0.01),SHR4m-o组(1.93±0.35,P<0.05)和SHR24m-o组(1.78±0.08,P<0.05)的mRNA水平均明显增加;(2)Western blotting结果显示:老龄及高血压大鼠心房肌TRPC3、纤维化生物标志物蛋白表达均增加;与WKY4m-o组(2.11±0.32)相比,TRPC3的蛋白表达量在WKY24m-o组(2.72±0.24,P<0.05)和SHR4m-o组(3.20±0.03,P<0.01)表达均明显增加;与WKY4m-o组相比,Col-Ⅰ蛋白水平,在SHR4m-o组(4.94±0.08vs8.45±0.38,P<0.01)和SHR24m-o组(4.94±0.08vs7.54±0.23,P<0.05)明显增加;与WKY4m-o组相比,Col-Ⅲ的蛋白表达在WKY24m-o组(2.15±0.32vs1.02±0.007,P<0.05)和SHR4m-o组(1.89±0.04vs1.02±0.007,P<0.05)明显增加。与WKY4m-o组相比,TGF-β1蛋白表达在WKY24m-o组(2.15±0.32vs1.02±0.007,P<0.01),SHR4m-o组(1.95±0.04vs1.02±0.007,P<0.01)和SHR24m-o(1.83±0.11vs1.02±0.007,P<0.05)心房组织中均明显增加。3.慢病毒TRPC3RNAi感染心房成纤维细胞对纤维化标志物蛋白表达的影响:慢病毒TRPC3RNAi感染心房成纤维细胞72小时后,发现TRPC3表达下调可明显降低TGF-β1(0.47±0.04vs0.32±0.032,P<0.05)的表达;;4.TRPC3通道阻断剂对AngⅡ诱导的细胞增殖和迁移的抑制作用:(1)划痕实验:细胞贴壁生长到细胞融合度70-80%进行划痕实验,在TRPC3通道阻断剂处理0小时和48小时的细胞进行划痕实验成像,与对照组相比,AngⅡ组的成纤维细胞增殖明显增加,而TRPC3通道阻滞剂Pyr3可明显抑制AngⅡ导致的成纤维细胞的增殖。(2)迁移实验:Transwell迁移法检测细胞迁移,AngⅡ能显著增加成纤维细胞的迁移,而Pyr3能降低AngⅡ刺激下成纤维细胞的迁移(n=4,P<0.01);5.TRPC3特异性阻滞剂Pyr3对AngⅡ诱导的细胞内Ca2+释放的影响:在无钙溶液条件下,Pyr3能显著降低钙瞬变的幅度(n=6,P<0.05),加入1μmol/L AngⅡ后,Control组和Pyr3预处理组的钙瞬变值与无钙条件下幅度明显增强;将溶液转变为1.8mmol/L CaCl2,相较于加入AngⅡ时,对照组和Pyr3预处理组的钙瞬变值均明显增强,而Pyr3预处理的钙瞬变值明显低于对照组(n=6,P<0.05);
结论:1.老龄和高血压可导致心房纤维化;2.TRPC3在老龄和高血压心房中表达明显上调。3.TRPC3经AT1R/TGF-β1/Smad2/3信号通路上调参与了老龄和高血压导致的心房纤维化过程。4.TRPC3可能是老龄和高血压逆转心房纤维化的潜在的治疗靶点。