论文部分内容阅读
目的:肺癌在当今世界已经成为发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，是肿瘤防治的重要方面。虽然随着人们认识的提高和医学的进步，在癌症的预防、筛查、诊断和治疗，特别是手术治疗和靶向药物治疗等方面都有了很大的提高，但是肺癌仍然是全人类公共卫生事业的巨大挑战。近年来，随着分子生物学的不断发展，靶向药物的出现和更新换代，肺癌的治疗取得了长足的进步，但是肺癌患者的预后仍没有达到预期。因此，探究肺癌发生和发展的具体机制，发展更加有效的治疗手段迫在眉睫。 ATP结合盒转运子E1(ATP-binding cassette transporter E1，ABCE1)在真核生物细胞胞浆内编码一种名为核糖核酸酶L(Ribonuclease L)的抑制因子，分子量为68KD，属于ATP结合盒转运子基因亚家族。ABCE1基因不但在抗病毒、细胞凋亡、调节RNA稳定性及代谢方面发挥着及其重要的作用，而且与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移也是密切相关的。 在课题组前期研究中，应用RNA干扰技术成功构建带有绿色荧光标记的ABCE1-SiRNA表达载体，并在此基础上在体外进行细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力情况的检测，证明在将ABCE1-SiRNA导入肺癌细胞株后，ABCE1基因表达发生改变，细胞增殖、迁移及侵袭能力也随之发生变化。课题组应用基因芯片技术筛选出cyclin D1、CDK4等基因与ABCE1表达有差异，提示cyclin D1、CDK4及相关基因可能与ABCE1基因造成细胞周期变化相关。 本实验应用ABCE1上调及下调质粒瞬时转染肺腺癌细胞A549，探讨ABCE1基因改变对肺腺癌细胞A549细胞周期的影响及其可能的影响机制，为进一步实验打下基础。 研究方法:1、应用Western blot方法检测多种肺癌细胞中ABCE1在蛋白水平的表达，并选取蛋白表达中等量的细胞系作为转染的目标细胞系。2、LipofectaminLTX and PLUS介导的质粒瞬时转染入细胞。3、通过流式细胞仪检测转染后细胞周期的变化情况。4、Real time-PCR检测质粒转染肺腺癌细胞株A549与对照组空载体A549细胞及正常A549细胞中ABCE1、CDK4、cyclin D1、p16 mRNA表达的变化。5、Western blot检测质粒转染肺腺癌细胞株A549与对照组空载体A549细胞及正常A549细胞中ABCE1、CDK4、cyclin D1、p16蛋白表达的变化。 结果:1、Western blot检测ABCE1的蛋白表达水平，结果发现肺腺癌细胞A549中ABCE1蛋白表达量较其他细胞为中等量表达，故选取A549细胞系作为转染质粒的细胞系。2、Lipofectamin LTX and PLUS介导的细胞转染，用ABCE1上调及下调质粒转染A549细胞48小时后，通过荧光显微镜可见细胞胞浆内的绿色荧光。3、流式细胞仪检测转染后的A549细胞周期发现，上调ABCE1基因的A549细胞中处于G1期的细胞减少，而S期和G2期的细胞增多;下调ABCE1基因的A549细胞中处于G1期的细胞增多，而S期和G2期的细胞减少。4、通过Real time-PCR检测发现，上调ABCE1基因的A549细胞中CDK4、cyclin D1的mRNA表达升高，而p16的mRNA表达下降;下调ABCE1基因的A549细胞中CDK4、cyclin D1的mRNA表达下降，而p16的mRNA表达升高。5、通过Western Blot检测发现，上调ABCE1基因的A549细胞中CDK4、cyclin D1蛋白表达升高，而p16蛋白表达下降;下调ABCE1基因的A549细胞中CDK4、cyclin D1蛋白表达下降，而p16蛋白表达升高。 结论:1、ABCE1表达的变化可影响肺腺癌细胞A549的细胞周期。2、ABCE1基因可能与CDK4、cyclinD1、p16共同影响肺腺癌细胞A549的细胞周期。