趋化性是指具有鞭毛结构的细菌能够敏锐地感知周围环境中存在的化学信号浓度梯度,并自主地做出有效的反应,如向着有利的物质迁移或者逃离有害物。趋化性对于细菌在恶劣的、营养贫瘠的环境中生存至关重要,同时趋化过程也是病原微生物侵染宿主过程中重要的环节之一。细菌的趋化性广泛存在于绝大多数已完成测序的细菌中,其中研究最为透彻的是大肠杆菌。模式细菌大肠杆菌具有一套完整的趋化系统,包括7个重要的组分蛋白:甲基趋化受体蛋白MCP、甲基转移酶CheR、偶联蛋白CheW、蛋白激酶CheA、甲基酯酶CheB、趋化响应调节蛋白CheY和磷酸酶CheZ。当甲基趋化受体蛋白MCP识别到环境中的趋化信号后,这些受体蛋白与偶联蛋白CheW、蛋白激酶CheA形成的三元核心复合体发生结构上的微妙变化,即能控制磷酸信号输出,直接影响反应调节蛋白CheY的磷酸化程度,从而减少结合到鞭毛根部马达开关复合物的两个组分（FliM和FliN）上的磷酸化的CheY（CheY-P）的量,继而调整马达旋转方式使细菌做出相应的运动反应。根癌农杆菌是一类在植物根系表面及周边土壤处分布的革兰氏阴性细菌,因其能够自主转移自身一段T-DNA基因并将其整合进宿主基因组,成为当下植物转基因工程中重要的工具菌。与大肠杆菌一样,根癌农杆菌也具有鞭毛结构和趋化能力,但是也有很多不同之处。根癌农杆菌趋化系统编码有20个甲基趋化受体蛋白MCP、两个偶联蛋白CheW以及两个趋化响应调节蛋白CheY（分别被atu0516和atu0520基因编码）。目前,关于根癌农杆菌趋化系统为什么只有一个蛋白激酶CheA却需要编码两个调节蛋白CheY以及两个CheY具体的生物学功能尚不清晰。生物信息学分析结果显示根癌农杆菌的两个CheY在大体结构上与大肠杆菌的CheY（EcCheY）较为相似,但是根癌农杆菌两个CheY蛋白的同源建模结构之间的骨架原子位移均方根偏差仅为2.507 （?）,暗示两者在趋化信号传导中可能发挥不同的调节效率,甚至不同的作用。基于此,本研究通过三章内容深入解析根癌农杆菌的两个CheY的生物学功能,分析两个CheY在调节趋化信号方面的差异以及造成这种差异的分子机制,同时也拓展研究了两个CheY在调节趋化性以外如粘附、胞外多糖合成、生物被膜形成和致病性等方面的影响,为拓展认知趋化响应调节蛋白的生物学功能提供参考。主要研究结果总结如下:1、atu0516（cheY1）和atu0520（cheY2）基因受同一个趋化启动子调控,cheY基因的缺失不影响根癌农杆菌的正常生长和鞭毛的合成。首先通过无标记反向筛选同源重组法精准构建了两个cheY基因阅读框内删除的单基因缺失突变体和双基因缺失突变体,然后测定了构建成功的突变体的生长曲线,结果表明在实验室摇瓶培养条件下cheY1和cheY2基因的缺失不影响根癌农杆菌细胞的正常生长。接着通过透射电镜观察突变体的鞭毛结构,结果表明两个cheY基因缺失不影响鞭毛的合成与组装。敲除趋化基因簇的启动子后发现,根癌农杆菌的趋化性完全被消除。进一步地,荧光定量PCR分析显示缺失趋化启动子的根癌农杆菌突变体的cheY1和cheY2的转录水平明显下降,表明cheY1和cheY2基因受同一个趋化启动子转录调控。通过对液体培养和平板固体培养的细菌提取总RNA进行分析,结果显示平板固体培养的细菌的趋化操纵子转录水平与液体培养情况下的转录水平基本一致,这说明短期的不同生长状态不会影响趋化基因簇的表达。2、cheY1和cheY2基因共同参与趋化性的调节,其中CheY2是主要的趋化信号调节蛋白,CheY1辅助CheY2传导趋化信号,两者调节效率的差异主要来源于与下游FliM亲和力的不同,且马达结合面上关键氨基酸残基的差异是导致两个CheY功能分化的重要分子机制。首先通过游动平板法探究了两个cheY基因缺失突变体对营养物质的综合趋化响应,结果表明cheY2基因的缺失彻底中断了细菌的趋化信号传导,而cheY1缺失轻微地影响了趋化性,并且在cheY2基因缺失的情况下,cheY1不能单独调节趋化性。进一步地,cheY突变体单一细胞运动行为的观测结果证明,cheY2主要负责调控根癌农杆菌鞭毛马达的旋转速率和方式,cheY1基因的回补不能对根癌农杆菌的运动行为造成显著影响。分裂荧光法进一步表明CheY1和CheY2均能与CheA在根癌农杆菌细胞内结合形成复合物,并定位在细胞的一端。无论CheS是否存在,和CheY2相比,CheY1都能与CheA形成更多的细胞内荧光极点定位。接着,通过细菌双杂交和Western Blot法对CheY1、CheY2与CheA的相互作用进行探究,结果都显示CheY1和CheY2与CheA的亲和力在同一数量级,这也表明CheY1和CheY2的功能差异不是来源于与CheA的亲和力差异。而CheY1和CheY2与FliM的亲和力差异较为显著,CheY2-P与FliM的亲和力是CheY1-P与FliM的5倍之多,这暗示CheY1和CheY2功能差异来源于与下游FliM的作用机制不同。随后,通过对CheY1和CheY2蛋白C端的关键氨基酸残基进行相互替换,进一步验证这一推论,即α4-β5-α5结构域上关键氨基酸的差异导致两个CheY调节趋化信号的效率有显著的不同。在研究中意外地筛选到两株显著提高趋化活性的CheY2蛋白变异体,对植物分泌信号、蔗糖和乙酰丁香酮（AS）的响应结果均证明了这两个变异体CheY2R93A和CheY2A109V在CheY1缺失的情况下,明显具有比天然CheY2更高的趋化调节活性,这也暗示通过相互替换同源蛋白在对应关键氨基酸的残基有可能提高原来蛋白的生物学功能。C端结构域的整体替换结果也证实,α4-β5-α5结构域是决定CheY功能的重要因素但不是唯一决定因素。最后,两个CheY与VirA相互作用的鉴定结果提供了 VirA直接参与根癌农杆菌对AS趋化响应的证据,VirA可能通过直接影响CheY2或CheY2-P参与对AS的响应调控,尽管VirA和CheY2之间的磷酸转移结果尚未得到证实。3、cheY2基因的缺失显著提高了根癌农杆菌细胞的粘附能力、胞外多糖的分泌、生物被膜的形成和致病性。通过对根癌农杆菌趋化关键组分的突变体（cheA、cheY突变体）及运动组件motA突变体粘附能力的测定,发现cheY2基因的缺失显著提高了根癌农杆菌细胞对亲水性生物表面和非生物表面的粘附能力。接着,测定cheY及相关突变体细胞对疏水性界面的粘附能力,结果显示cheY2的缺失显著提高了细胞对疏水性的烃类化合物辛烷的粘附,然而cheA和motA的缺陷对粘附的影响并不显著,这暗示cheY2可能通过一个独特的机制影响根癌农杆菌细胞粘附。随后刚果红试剂结合试验发现,三个cheY2缺失组（Δy2、Δy和Δy+y1）与刚果红试剂结合产生比其他实验组更深的红色反应,这意味着cheY2的缺失显著提高了根癌农杆菌胞外多糖的分泌。后续通过硫酸-蒽酮法也进一步定量地证明了这一结论。通过典型的玻璃试管生物被膜形成法验证了各组待测菌株的固体界面联系的生物被膜（SSA-biofilm）形成能力,结果表明cheY2基因相关缺失组最先从液体自由生长切换到固体附着生长模式,并且积累最多的生物被膜产物。磷酸化活性位点的突变体CheY2D58A、C端结构域杂合体NY2CY1和大肠杆菌的EcCheY均不能有效恢复由根癌农杆菌cheY2缺失引起的生物被膜异常产生的表型,这表明CheY2对根癌农杆菌生物被膜的影响依赖其相对专一的、且具有活性的完整结构和空间构象。之后,致病侵染实验也表明cheY2基因的缺失显著提高了根癌农杆菌对根、茎、叶为代表的三种植物宿主的肿瘤发生。RT-PCR结果显示cheY2基因的缺失能够显著影响数种DGCs和PDEs酶的转录水平,其中atu1114、atu3207和atu4490的过表达能够显著降低cheY2缺陷引起的异常生物被膜形成水平,这表明cheY2基因的缺失至少影响了三个重要的、具有较强分解环二鸟苷酸（c-di-GMP）活性的磷酸二酯酶（Atu1114、Atu3207和Atu4490）的表达水平,导致细胞胞外多糖的大量分泌以及生物被膜的大量累积。最后,细菌双杂法检测CheY2与根癌农杆菌中30个DGCs和PDEs家族蛋白的相互作用,结果表明CheY2与Atu0701、Atu1119和Atu1257异源表达在大肠杆菌体内有明显相互作用,可能因此直接参与c-di-GMP的相关调控。