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【研究背景】在组织处理过程中，组织的固定至关重要。在过去的一百年中甲醛是国际上通用的组织固定液，但是用甲醛固定组织主要存在以下缺点：①易挥发，有毒。②易引起组织内形成广泛的蛋白质交联，影响免疫组织化学染色中抗原决定簇的暴露。③易导致DNA断裂，交联作用阻碍核酸的提取并局限了DNA片段的PCR扩增产物的长度。近年来，随着分子生物学技术的不断发展及疾病相关基因研究的不断深入，分子病理学检测已成为病理诊断的重要辅助手段。在形态学、免疫组织化学、相关遗传物质保存等方面优于甲醛的绿色环保固定液成为研究热点。【研究目的】探讨不同成份固定液对组织形态学的保存、组织化学、免疫组织化学染色以及对提取组织DNA片段长度完整性的影响。【研究方法】1固定液的配制：本实验室内配制三种无醛固定液：①R固定液（以RCL-2固定液主要成分为参考）；②U固定液（以UMFIX固定液主要成分为参考）③W固定液(以Weigners fixative主要成分为参考)，④对照固定液F（4%中性甲醛固定液）。2标本收集：收集外科手术送检的新鲜标本48例：胃癌9例，直肠癌5例，肺癌6例，正常甲状腺10例，正常乳腺10例，子宫肌瘤8例。按照《临床技术操作规范（病理学分册）》的要求，肿瘤标本选取正常组织与肿瘤组织交界，正常标本选取正常组织分别切取2cm×1.5cm，厚度为3mm的组织块4块，装入包埋盒中，分别置于固定液R、固定液U、固定液W、以及4%中性甲醛固定液（F）中，于室温下固定12小时，常规脱水，石蜡包埋。3μm连续切片粘附于载玻片，用于HE染色，形态学观察。6μm连续切片5片存于1.5ml的Eppendorf管中用于DNA提取，PCR扩增，GAPDH基因检测。3组织形态学评判：切片进行HE染色，从整体形态、整体染色、核染色、细胞轮廓、红细胞的完整性、细胞质染色等6个方面给出评分，并比较不同组分固定液对组织形态学的保存效果的影响。4组织化学染色（特殊染色）：PAS染色比较不同组分固定液对中性黏蛋白保存效果；MASSON三色染色、网状纤维染色和弹力纤维染色比较不同组分固定液对纤维结缔组织的保存效果和染色效果的影响。5.免疫组织化学染色：CK、EMA、SMA、Desmin、P63、34βE12、TTF-1、Cadherin-E、CK7染色、评分，并比较不同组分固定液对抗原保存效果的影响。6.基因组DNA提取及验证：行OD260及OD260/OD280对提取的DNA浓度、纯度、完整性进行检测及GAPDH基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳，观察PCR产物扩增的效果，评估其模板的完整性来比较不同组分固定液对DNA保存效果的影响。【结果】1．组织形态学染色：整体形态和整体染色及核染色上，R组获得了最高分数（整体形态得分：3.44；整体染色得分：3.45；核染色得分：3.25）；F组获得了最高的细胞轮廓得分（3.26）和最高的红细胞完整性得分（3.31）；W组得分最低，与其他三组差异明显（P<0.05）。2．组织化学染色：胃组织PAS染色中： F组PAS染色中阳性物质呈现很强的紫红色；R组阳性物质有溶解的迹象出现，而且在细胞内的分布有偏向细胞一极聚集的现象发生；U组染色色彩鲜艳；W组阳性物质着色暗淡。甲状腺胶质在PAS染色中：F组染色暗淡；R组和W组胶质收缩明显；U组呈现均质状。Masson染色中：U组和R组颜色深而鲜亮，肌纤维的红色着色和胶原纤维的绿色着色对比鲜明，F组和W组染色暗淡，各种纤维染色对比不明显。弹力纤维染色：F组和U组弹力纤维着色清晰，背景干净；而R组和W组弹力纤维分布杂乱，断裂，染色背景相对模糊。网状纤维染色：R组背景干净，网状纤维显示清晰；F组出现过染现象；U组染色较差，网状纤维难以辨认；W组背景染色较深，仅显示出少量的网状纤维。3免疫组织化学染色：①CK、EMA、SMA、Desmin、P63、34βE12、TTF-1：F组与R组各指标得分无明显差异,与U组及W组显著性差异（P<0.05）。②Cadherin-E：F组和R组、U组、W组得分有显著性差异（P<0.05）；③CK7：F组和U组及R组得分在统计学上无明显差异（P>0.05），F组和W组的差异明显（P<0.05）。4抽提的组织基因组DNA含量：R组DNA含量最高（OD260=0.029）（P<0.05），依次为U（OD260=0.025）、W（OD260=0.021）、F（OD260=0.020）；OD260/OD280比值均没有明显差异（P＞0.05）。5GAPDH基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳：①乳腺组织：R组、U组均有明显的目的DNA扩增条带，W组目的条带不清晰，F组几乎没有目的条带；②甲状腺组织：R组、U组、F组均能看到清晰目的条带，F组出率较低；W组没有目的条带；③胃组织：R组、W组均有清晰目的条带，F组目的条带比较模糊，U组几乎没有目的条带；④肠组织： R组、U组、W组目的条带清晰可见，F组目的条带很淡；⑤子宫组织： R组、U组都能看到清晰的目的条带，W组条带比较模糊，F组几乎没有目的条带，；⑥肺组织：R组能看到清晰的目的条带，U组次之，U组条带比较弱，，W组目的条带不清晰且杂乱，F组目的条带出率很低。【结论】1、甲醛仍是形态学保存效果最好的固定剂。，2、甲醛固定液和U固定液对糖类和弹力纤维的保护能力较好，而在网状纤维保护方面， R固定液效果最好。3、甲醛固定液仍然是核、浆、膜抗原保存效果最好的固定剂，R固定液对和抗原的保护作用同甲醛固定液。4、对组织基因组DNA的提取量和完整性来说，R固定液最好，甲醛固定液最差。