奶山羊产业是我省的特色产业,目前被作为扶贫项目和优势产业正加以培育。IGF是羊奶制品中一类重要的广谱促生长因子,负责调节机体包括增殖、分化、能量代谢、葡萄糖稳态在内的多种细胞过程。有临床报道指出,重组人IGF-1可以用于治疗生长发育迟缓和辅助胰岛素治疗糖尿病。事实上,我们认为,羊奶在《本草纲目》中被指出可以治疗消渴症,可能由于其中IGF因子发挥了降糖的作用。羊奶中IGF-1因子的含量约为5-150 ng/mL,对其测定多采用放射免疫法。但该法耗时长、成本高且应用范围受限。本课题旨在制备重组山羊IGF-1蛋白,筛选效价稳定、优质高效的单克隆抗体,并利用该单抗开发定量检测羊奶中IGF-1含量的ELISA方法,为持续监测羊奶制品中的IGF-1因子含量提供简便、经济、适用的检测手段。首先,本课题拟利用pET 28a载体构建技术、原核表达技术制备出山羊IGF-1蛋白。用重组山羊IGF-1蛋白刺激骨骼肌细胞,通过检测骨骼肌细胞的细胞增殖情况和葡萄糖吸收量,鉴定重组山羊IGF-1蛋白的活性。其次,用纯化后的IGF-1蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤抗体技术制备山羊IGF-1单克隆抗体,并应用蛋白A/G琼脂糖纯化树脂对得到的单抗进行纯化。然后,用得到的单克隆抗体对山羊乳腺上皮细胞进行Western Blot检测和免疫荧光染色,确定抗体的特异性及抗体的应用范围。最后,以商品化IGF-1多抗（兔源）为捕获抗体,以自制的单抗为检测抗体采用双抗体夹心技术对羊奶、牛奶中的IGF-1因子进行定量检测,并建立奶制品中检测IGF-1因子含量的ELISA方法。根据以上研究内容,本课题取得的研究结果如下:1.对pET 28a表达载体及含IGF-1 DNA序列的克隆载体进行双酶切,经T4连接酶连接后,成功构建了IGF-1融合蛋白原核表达载体,并转化到Shuffle T7K12菌株中。接着,对蛋白诱导条件进行了优化,发现IGF-1-pET 28a-Shuffle T7K12重组菌在37℃、0.5 mmol/L IPTG浓度下诱导8 h时,目的蛋白表达量较高。在后续的镍柱蛋白纯化实验中,确定了洗脱杂蛋白的咪唑浓度为20 mmol/L,目的蛋白的最佳洗脱浓度为300 mmol/L。2.在MTT细胞增殖实验中,当Rg IGF-1蛋白在5 ng/mL至50 ng/mL的浓度范围内时,细胞活力值均大于1.23,与阴性对照组相比表现出显著性差异,且在5 ng/mL时相较于Rh IGF-1阳性对照组表现出更强的刺激细胞增殖能力。接着用IGF-1刺激分化了的L6成肌细胞,发现Rg IGF-1实验组在100 ng/mL时,葡萄糖的消耗量相对于未刺激的对照组增加了24%,Rh IGF-1阳性对照组在100ng/mL时,葡萄糖消耗量相对于未刺激对照组增加了19%。结果显示,Rg IGF-1蛋白与Rh IGF-1有近似的降糖效果。3.通过将脾细胞和SP2/0细胞融合,从而获得杂交瘤细胞。对杂交瘤细胞进行三次克隆化,获得了两株能特异性针对重组IGF-1蛋白的阳性杂交瘤细胞株,分别命名为E9和B3。4.以山羊乳腺上皮细胞为样本,利用E9和B3两种抗体做一抗,用免疫荧光的方法均能检测到IGF-1蛋白的存在。以人前列腺癌上皮细胞22RV1为对象,通过Western Blot在目的条带处也检测到中的IGF-1蛋白。利用灵敏性较高的双抗夹心ELISA,针对不同含量的重组IGF-1蛋白,检测其OD值并得到了一条标准曲线。根据该曲线,计算出羊奶、牛奶样品中的IGF-1含量,分别为79.39 ng/mL和31.00 ng/mL。根据以上结果,本课题得出以下结论:1.通过本文中的山羊IGF-1可溶性原核表达体系及蛋白纯化体系,可以得到有活性的山羊IGF-1蛋白。重组的IGF-1蛋白具有刺激大鼠骨骼肌细胞增殖的能力和促进大鼠骨骼肌细胞对葡萄糖吸收的能力。2.两株分泌山羊IGF-1单克隆抗体的杂交瘤细胞E9和B3,均可用于免疫荧光检测和Western Blot检测;同时,这两株抗体均表现出对人IGF-1的交叉反应性。3.通过应用E9抗体株,建立了检测羊奶和牛奶中IGF-1含量的ELISA方法。通过ELISA检测结果,我们发现E9单抗也可以识别牛IGF-1蛋白,但不能识别羊的IGF-2蛋白。该ELISA方法的建立,为后续筛选出富含IGF-1蛋白的优质羊/牛奶提供了实验方法和手段。为提升奶山羊产业水平、打造具有陕西特色的功能性羊奶奠定基础。