肺炎链球菌是呼吸道感染和全身侵袭性感染的主要病原菌，近年来大环内酯耐药肺炎链球菌(MRSP)在世界范围内广泛传播，以亚洲国家和地区的肺炎链球菌对大环内酯类抗生素耐药最为严重，且表现出对四环素、复方磺胺、氯霉素、青霉素等的多重耐药。在我国，肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药远超过对青霉素的耐药，大环内酯类抗生素耐药的肺炎链球菌的出现给青霉素过敏患者或耐药肺炎链球菌感染的治疗带来极大困难。目前我国对肺炎链球菌耐药研究以流行病学调查为主，对：MRSP进化、传播和调控的分子机制缺乏深入研究。本研究通过对肺炎链球菌耐药表型、基因型检测及分子进化学分析，掌握本地区肺炎链球菌耐药的现状和趋势；通过对转座子结构及转移特性分析，解明转座子在肺炎链球菌大环内酯类抗生素耐药发生和播散中的作用；通过对ermB调控序列多态性与耐药表型、mRNA水平的关系分析，了解调控序列突变对耐药基因表达的影响；从而为有效治疗肺炎链球菌感染和控制肺炎链球菌的耐药性提供理论依据。 (1)上海地区MRSP耐药表型及耐药机制 本文用E试验和K—B纸片扩散法检测118株红霉素耐药肺炎链球菌临床分离株对12种抗生素的敏感性；用双纸片法确定大环内酯类耐药表型；用PCR扩增和DNA序列测定检测耐药基因ermB、mefA、mefE、msrD、tetM Tnl545-Tn916家族转座子整合酶基因intTn及核糖体蛋白L4、L22租23SrRNA突变。结果表明①118株肺炎链球菌对红霉素的MIC范围为4～256μg／m1，其中5.9％对克林霉素敏感，对青霉素不敏感率达72.7％。左氧氟沙星、阿莫西林／克拉维酸对红霉素耐药的肺炎链球菌仍有较好的体外活性；②该组细菌耐药基因ermB检出率为88．1％，mefE、msrD同时阳性的检出率为50％，未检出mefA基因，转座子整合酶基因intTn和terM同时出现的检出率达97.5％。耐药基因组合模式以ermB（+）mefE（+）msrD（+）terM（+）intTn（+）和ermB（+）mefE（-）msr（-） terM（+）intTn（+）为主。二者均呈cMLS<，B>耐药表型。ermB（-）mefE（+）msrD（+）terM（+）intTn（+）模式占5.9％，耐药表型为M型。③临床菌株814和816核糖体23SrRNA分别有两个等位基因发生G2057A，A2059G突变，结合核糖体蛋L22基因G165A改变，导致细菌对ML抗生素的耐药，此为国内首次报道。研究提示上海地区肺炎链球菌大环内酯耐药以CMLS<，B>表型为主，由ermB基因或ermB和mefE基因共同介导；大环内酯外排基因有流行趋势，但仅限于起源于肺炎链球菌的mefE；同时核糖体突变引起的大环内酯耐药不容忽视；转座子可能在本地区肺炎链球菌耐药基因的传播中起重要作用。 (2)上海地区MRSP分子进化学研究 为了解ermB和mefE基因同时阳性菌株的遗传背景和可能的进化路径，采用BOX-PCR和PFGE方法对47株临床分离MRSP进行同源性分析，并运用多位点序列分型(MLST)对其中6株多重耐药MRSP进行分子进化学分析，结合血清分型推测其来源及与国际流行克隆株的关系。结果显示①上海地区ermB和mefE阳性菌株中存在流行克隆A型(45％)、B型(17％)。②PFGE图谱A型的6株多重耐药MRSP菌株都属于亚洲流行克隆CC236(Taiwanl9F-14 clone)。③上海地区发现一个新的MLST型别ST2116(15-16-19-15-6-20-125)，推测其NCC236经基因水平交换进化而来。以上结果提示上海地区ermB和mefE阳性菌株的快速增加部分是由于耐药克隆株的播散，同时抗生素作用压力下基因的水平交换使得耐药克隆株不断进化。耐药菌株的克隆播散和耐药基因的水平传播共同导致了肺炎链球菌对大环内酯的高度耐药。 (3)肺炎链球菌转座子介导的耐药水平传播机制研究 前期研究结果显示转座子介导的耐药基因水平转移也是本地区MRSP高发的主要原因。因此本部分研究采用LA-PCR、DNA序列分析、southem杂交、PFGE等方法分析3株不同遗传背景的肺炎链球菌中转座子的种类、结构，用转化和接合实验分析其在不同菌株之间耐药性转移方式。研究结果表明①携带mefE的mega元件插入到接合转座子Tn916上形成复合转座子Tn2009-like，其与Tn2009具有99％同源性，但染色体插入位点完全不同。②临床分离的3株MRSP中检出转座子Tnl545,Tngl7以及Tn2009—like，其中M耐药表型的菌株(71)仅携带Tn2009-like，MLS<,B>表型的两株菌中一株(81)携带Tn1545和Tn2009-like，另一株(86)则同时携带三种转座子结构。③国内外首次发现临床分离多重耐药菌株(86)染色体184kb和155kb片段上同时携带Tnl545,Tn917和Tng009-like ,体现出携带耐药决定子的遗传元件集中分布的趋势。以上结果提示肺炎链球菌染色体上转座子可捕获其他耐药元件形成复合转座子，且不同的转座子在染色体上集中分布、协同作用，促进耐药性的传播和进化。 (4)肺炎链球菌核糖体甲基化酶基因(ermB)表达特性研究 ermB基因的组成或诱导表达特性受上游调节区序列控制，其表达水平与调控序列多态性密切相关。我们对上海地区86株红霉素耐药肺炎链球菌的耐药表型及Tn1545和Tng1中ermB基因调控序列进行检测，以分析ermB基因调控序列多态性与耐药表型的关系，并通过SYBR Green实时荧光定量RT-PCR分析ermB基因的表达水平，以明确ermB基因表达特性。结果表明Tn9/7组中三株菌发生ermB基因启动子区194bp片段的删除和前导肽N末端T从A插入，SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR结果表明其ermB mRNA表达量明显高于未突变株，证实TAAA插入导致了ermB基因的高表达；我们还首次发现转座子Tn1545和ermB启动子-35区TGT缺失及核糖体结合位点AGGAG→AGGAGAG，其对ermB基因表达水平的影响正在进一步研究中。上海地区大环内酯耐药肺炎链球菌ermB基因主要由Tnl545(87％)携带，大多呈高水平、组成型表达，介导了对MLS〈,B>抗生素的高度耐药，且表现多重耐药的特点。