应用Real-time PCR和RPA技术检测青海省小麦条锈菌越冬菌源

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青海省是我国条锈病重要越夏菌源基地,区域内小麦全年无间断种植与分布,冬麦、晚熟春麦、自生麦苗为小麦条锈病持续侵染、流行提供大量的寄主。由于条锈菌毒性频繁变异导致品种抗性丧失,条锈病频繁暴发流行,造成了严重的经济损失。近年来,由于国家对核心菌源区的大规模治理,陇南越夏区菌源量逐渐减少,随着青海冬小麦种植面积不断扩大,青海现已成为我国小麦条锈菌越夏面积和菌源量最大的菌源基地,同时区域内可以完成越冬,形成周年循环,越冬菌源对病害流行的作用需要明确和评估。本研究q-PCR和RPA技术对青海省小麦条锈菌的越冬情况进行分析。主要研究结果如下:(1)为了研究青海省小麦条锈菌在小麦潜育期叶片中的菌源量,本研究以小麦条锈菌延伸因子EF1为引物,利用实时荧光定量PCR方法建立了小麦条锈菌潜育期菌源量的检测体系。结果表明:小麦条锈菌延伸因子EF1引物能从小麦条锈菌叶片g DNA中扩增出特异性目的片段243 bp。小麦条锈菌实时荧光定量PCR(Quantitivate PCR,q PCR)检测体系灵敏度是常规PCR检测灵敏度的100倍。对接种小麦条锈菌后的铭贤169叶片接种后第1到8 d均能检测到条锈菌,且菌源量随着天数的变化呈指数型增长趋势。本研究建立的检测体系可快速准确的检测到小麦条锈菌在潜育期叶片中的菌量。(2)本研究以小麦条锈菌的效应基因PS4593为靶标基因,设计了重组酶聚合酶技术引物PS-RPA-F,PS-RPA-R及探针PS-LF-Probe,结合测流层析试纸,有关小麦条锈菌重组酶聚合酶检测方法被建立,该方法可在39℃恒温条件下,10min内可检测到小麦条锈菌,该结果和普通PCR检测结果一致。通过该技术检测到小麦条锈菌下限为10fg/μL,检测结果与常规PCR检测无差异。此外,小麦条锈菌RPA快速检测方法可从田间潜育期小麦叶片中检测到小麦条锈菌,具有较强的实用性。因此,本研究建立的小麦条锈菌RPA检测方法具有高效、快速、普遍实用性、操作简便,等特点,为小麦条锈菌的早期检测和防治提供了理论基础。(3)2020-2021年在青海省设立6个越冬监测点,监测结果表明:在大史家村、下多巴村、舍仁村和阿河滩村形成了发病中心,其中大史家村和阿河滩村的病叶率最高。田间标记小麦进行温室移栽后综合越冬情况为阿河滩村>大史家村>舍仁村>下多巴村>上多巴村、贺尔加村。在扬花期和抽穗期发病情况如下:贵德县大史家村有70%标记植株发病;阿河滩村发病率为46.15%。其他标记点均发病较轻。分析该年份日均温度得出大史家村、贺尔加村的日平均温度在12月下旬到翌年1月下旬在-5℃-0℃之间,上多巴村,下多巴村和阿河滩村在该时间段内的日均温度最低达到了-8℃。对温湿度与菌源量相关关系进行相关性分析,结果发现,小麦条锈菌菌源量与12月、1月平均温度有显著相关性,与11月、1月份以及2月份湿度有显著相关性。整体上,1月份温湿度与条锈菌菌源量相关性比较大。综合分析结果表明;2020-2021年小麦条锈菌可在青海省贵德县大史家村,化隆县上多巴村、舍仁村以及阿河滩村顺利越冬,且在大史家村和阿河滩村发病最严重。
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