肝癌依然是世界范围内的顶尖癌症杀手之一，高密度的血管形成不但是肝癌转移复发诱因，而且还是肝癌组织营养供给的主要途径。诸多关于血管生成的研究已经证实，血管生成过程极其复杂但受到包括VEGF, PDGF, FGF,Endostatin等相关因子的严密调控。另外，近年来的研究也证实了miRNAs在血管生成中的重要作用。除此之外，肿瘤细胞自身形成拟态结构也被证实和血管生成在转移，血供等方面具有相辅相成的作用。尽管如此，对恶性肿瘤的血管生成和拟态过程相关调控机制的认识还有待进一步提高。　　作为miRNAs加工成熟和功能执行的重要因子AGO2(Argonaute-2，又称EIF2C2)蛋白，是AGO家族中唯一具有限制性酶切活性的成员，也是RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）的必要催化组分，能通过多种作用机制参与非编码小RNA(small non-coding RNA)诱导的特异性基因表达负调控过程。近年来也有研究表明，AGO2在多种恶性肿瘤组织中存在表达显著上调现象，参与多种癌细胞相关调控网络，比如EGFR、AKT3、MAPK、FAK等，在癌症发生发展中发挥重要的作用。已有报道称，通过siRNA技术抑制人脐静脉上皮细胞(HUVECs)中Ago2基因的表达，能有效抑制其新生血管生成过程，揭示出AGO2与血管生成两者之间的直接联系。另外，前期研究发现AGO2在肝癌组织中存在高表达的现象，干扰Ago2基因的表达对肝癌细胞的体外增殖没有显著影响，但对肝癌细胞的移植瘤体内生长具有显著的抑制作用。　　因此，在本研究中，利用siRNA干扰技术对肝癌细胞株Huh7和SMMC-7721中的Ago2基因进行干扰，在体内外检测Ago2基因干扰后对肝癌细胞的血管生成和拟态形成能力的影响，并进行多方面验证。主要的方法与结果如下:　　一、 Ago2基因的干扰对肝癌细胞血管形成体外研究　　采用慢病毒系统构建Ago2基因干扰的Huh7，SMMC-7721和对照的细胞株（分别命名为Huh7/7721-ctrl/siAgo2），采用RT-PCR技术在mRNA水平检测血管生成相关因子的表达情况，发现VEGF的表达受到显著抑制。进一步采用Westem Blot和ELISA技术在蛋白水平检测AGO2和VEGF在六种肝癌细胞株中的表达相关性（文中所有统计学P值均通过SPSS18.0软件采用t检验和 Pearson卡方检验算得），验证Ago2基因干扰对VEGF表达的影响，并采用与HUVECs细胞的3D共培养系统检验Ago2基因干扰对肝癌细胞血管生成因子分泌量的影响。实验结果表明:AGO2和VEGF在肝癌细胞株中存在显著的相关性，Ago2基因的干扰在mRNA和蛋白水平上均能显著降低VEGF的表达，并能削弱在共培养情况下肝癌细胞培养上清对HUVECs细胞微管结构形成的诱导能力。　　二、 Ago2基因的干扰对肝癌细胞血管生成影响的体内研究　　将数量1×107的Huh7-ctrl，Huh7-siAgo2和7721-ctrl，7721-siAgo2细胞分别皮下注射进行免疫缺陷型裸鼠移植，每组6只老鼠，注射后12天开始每4天测量一次肿瘤体积，测量三周后将所有老鼠脱颈处死，进行生长曲线分析，移植瘤体总质量称量和拍照，并将所有肿瘤组织浸泡于4％多聚甲醛中保存用于免疫组化检测AGO2，CD31和PTEN的表达情况。实验结果表明:相比对照的细胞来源移植瘤，Ago2基因干扰的肝癌细胞移植瘤生长速度、体积、重量以及AGO2和CD31的表达均显著下调。　　三、 AGO2与血管生成相互作用的机制研究　　前期研究显示PTEN在Ago2基因干扰的细胞中呈现表达上调现象，通过查阅文献资料，发现PTEN已经被普遍证实是著名的血管生成抑制因子。因此采用RT-PCR技术检测Ago2基因干扰后的肝癌细胞中PTEN的mRNA表达水平，蛋白免疫印迹、免疫组织化学和免疫荧光技术检测PTEN的体内外蛋白表达水平，并采用不同浓度的PTEN特异性抑制剂BPV培养Huh7/7721-siAgo2细胞后再对VEGF表达及其培养上清诱导微管形成能力进行检测。实验结果表明:相比对照细胞，Ago2基因干扰的肝癌细胞中PTEN的表达显著上调，当抑制PTEN的功能时，AGO2与VEGF的相互作用也被阻断。因此，PTEN是介导AGO2与VEGF相互作用的重要调控因子。　　四、 Ago2基因干扰对肝癌细胞拟态过程的影响研究　　将Ago2基因干扰和对照的细胞种植到铺好Growth Factor-Reduced Matrigel的3D培养六孔板中进行拟态形成过程体外验证，深度测序揭示Ago2基因干扰后引起一序列拟态相关重要因子的下调，进一步采用RT-PCR，Western Blot、免疫荧光和免疫组化技术对AGO2、TWIST1、VE-cadherin、E-cadherin的表达进行检测。实验结果表明:Ago2基因干扰对Huh7、SMMC-7721细胞的拟态过程具有抑制作用，通过测序发现TWIST1的表达水平也因Ago2基因的干扰受到抑制，蛋白免疫印迹和免疫荧光进一步验证了AGO2通过TWIST1调控肝癌细胞的拟态过程，而且TWIST1已经被证实和肝癌细胞拟态具有正相关性。因此AGO2是否是通过与TWIST1的相互作用来调控肝癌拟态过程的及其机制有待进一步探索。