【摘 要】
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乳腺炎是奶牛场中最重要的疾病之一。临床和严重的亚临床乳腺炎不仅对乳房组织造成损害,而且使奶制品产量和质量有所下降,因此,揭示奶牛乳腺炎发病机制对于奶牛乳腺炎的有效防控尤为重要。miRNA作为一类非编码RNA分子,广泛参与包括奶牛乳腺炎在内的疾病的发生和发展过程,CCR10是趋化因子CC亚家族的成员之一,在炎症和癌症的发生与发展中起着至关重要的作用。本试验研究基于实验室前期高通量测序分析结果,筛选出
【基金项目】
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河南省高等学校重点科研项目（21A230002）； 河南省科技攻关项目（222102110046）；
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乳腺炎是奶牛场中最重要的疾病之一。临床和严重的亚临床乳腺炎不仅对乳房组织造成损害,而且使奶制品产量和质量有所下降,因此,揭示奶牛乳腺炎发病机制对于奶牛乳腺炎的有效防控尤为重要。miRNA作为一类非编码RNA分子,广泛参与包括奶牛乳腺炎在内的疾病的发生和发展过程,CCR10是趋化因子CC亚家族的成员之一,在炎症和癌症的发生与发展中起着至关重要的作用。本试验研究基于实验室前期高通量测序分析结果,筛选出在健康奶牛乳腺组织和炎性奶牛乳腺组织中差异表达的miR-148a和CCR10,利用生物信息学软件、荧光定量PCR、RTCA、ELISA和流式细胞术等方法,最终我们揭示miR-148a通过靶向调控CCR10参与炎性条件下MAC-T细胞的增殖和凋亡的分子机制。试验主要研究结果如下:1.CCR10基因克隆与生物信息学分析本章节试验方法以NCBI数据库明确已知牛CCR10基因的mRNA序列作为模板设计相应的特异性引物,通过荧光定量PCR技术成功克隆CDS区,运用各种在线软件分析牛CCR10蛋白基因序列特性。研究结果表明:（1）试验成功克隆了牛CCR10基因CDS区,该蛋白主要存在于内质网中,是亲水性跨膜蛋白;（2）牛CCR10在不同种类动物中同源性分析结果中表明牛与绵羊的亲缘关系最近,系统进化树发现牛与鸡的亲缘关系最远;（3）在二级结构预测中,CCR10蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲构成。以上结果为今后进一步分析牛CCR10基因提供一定的理论参考基础。2.miR-148a靶向调控CCR10的分子机制研究利用在线网站Hybrid预测发现CCR10的3’UTR区域包含miR-148a的潜在结合位点。为了明确CCR10和miR-148a之间是否具有靶向调控关系,我们将已成功构建的PMIR-CCR10-3’UTR和PEZX-miR-148a载体通过瞬时共转染入293T细胞,然后测定双荧光素酶活性变化。结果显示:与control组相比,miR-148a+CCR10转染组在293T细胞中所表达的双荧光素酶活性显著降低(（P＜0.01）。在MAC-T细胞中分别转染NC、miR-148a inhibitor和miR-148a mimic,通过实时荧光定量PCR检测CCR10基因水平上表达量的变化,ELISA试验检测CCR10在蛋白水平上表达量的变化。试验结果表明:转染miR-148a mimic对CCR10 mRNA和蛋白的表达有抑制作用（P＜0.01;P＜0.05）,与之相反,转染miR-148a inhibitor对CCR10 mRNA和蛋白的表达具有促进作用（P＜0.01;P＜0.05）,本章试验结果表明miR-148a与CCR10之间存在靶向调控关系。3.炎症条件下miR-148a在奶牛MAC-T细胞中的功能研究本章节立足于实验室前期已成功构建的LTA炎症细胞模型,进行炎症条件下miR-148a在MAC-T细胞中的功能获得性和缺失性研究。在MAC-T中分别转染miR-148a mimic和miR-148a inhibitor,以及NC对照组,利用RTCA（实时无标记动态细胞分析技术）和流式细胞术检测了MAC-T细胞的增殖与凋亡的变化,ELISA检测细胞上清液中检测CCR10水平的变化。RTCA试验的结果显示过表达miR-148a对MAC-T细胞的增殖具有促进作用,抑制表达miR-148a对细胞增殖具有抑制作用。流式细胞术的结果显示转染miR-148a mimic可显著降低MAC-T细胞的凋亡（P＜0.05）,与之相反的是,转染miR-148a inhibitor可显著促进MAC-T细胞的凋亡。4.炎症条件下CCR10在奶牛MAC-T细胞中的功能研究为进一步研究在炎症条件下CCR10对MAC-T的影响,通过生物公司体外合成CCR10基因的si RNA模拟物（bta-CCR10-si-1）,将bta-CCR10-si-1染乳腺上皮细胞中。通过流式细胞术和RTCA技术检测奶牛乳腺上皮细胞的增殖与凋亡作用,同时利用ELISA试剂盒检测bta-CCR10-si-1干扰后CCR10在细胞上清液中的表达量。用流式细胞术和RTCA测试发现,与NC组相比,CCR10干扰后可显著促进乳腺上皮细胞的增殖;RTCA结果显示,CCR10干扰后对细胞增殖具有促进作用;ELISA结果显示,干扰后CCR10的蛋白表达量显著降低。综上所述,在炎症条件下奶牛乳腺上皮细胞中,miR-148a可以通过与CCR10基因3’UTR结合抑制其表达;靶基因CCR10被miR-148a调控可以促进乳腺上皮细胞的增殖,在分子水平和蛋白水平上更进一步参与到奶牛乳腺炎的发病过程中。
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